WWW.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 

Pages:     | 1 |   ...   | 3 | 4 || 6 | 7 |   ...   | 17 |

«Национальная академия наук Украины Институт микробиологии и вирусологии им. Д. К. Заболотного Институт биоорганической и нефтехимии Межведомственный ...»

-- [ Страница 5 ] --

Нами также было исследовано влияние флавоноидов кверцетина и гесперетина на ростовую активность клубеньковых бактерий горо ха (рис. 36). В работе использовали штаммы клубеньковых бактерий гороха R. leguminosarum 250б (высокоактивный) и R. leguminosarum 248а (неактивный).

Установлено, что исследованные флавоноиды стимулировали рост высокоактивного штамма R. leguminosarum и угнетали рост неактив ного штамма этого же вида. Ингибирующий эффект как гесперетина, так и кверцетина был одинаковым. При концентрации флавоноидов 5—10 мкг/мл зоны задержки роста R. leguminosarum 248а были в среднем 0,7—1,3 мм;

при увеличении концентраций флавоноидов до 70—100 мкг/мл ингибирующий эффект усиливался в 2,5—3 раза.

На газонах активного штамма R. leguminosarum 250б мы наблю дали эффект стимулирования роста. При концентрации кверцети на и гесперетина в питательной среде 5—10 мкг/мл зоны активи зации роста культуры были 1—2,5 мм, а при 70—100 мкг/мл — 2,5—2,8 мм.

Таким образом, изучение физиологической активности ризобий при действии на них флавоноидов является важным как с точки зрения понимания молекулярных механизмов взаимодействия ризо бий с растениями, так и для решения практических задач активиза рис. 36. Влияние флавоноидов кверцетина (а) и гесперетина (б) на ростовую активность R. leguminosarum:

1 — R. leguminosarum 250б;

2 — R. leguminosarum 248а ции роста бактерий в биотехнологии производства микробных препа ратов на основе симбиотических диазотрофов.

Наряду с физиологически активными веществами растительного происхождения всё больше внимания уделяется изучению влияния на микроорганизмы экзогенных соединений, обладающих фитогор мональным действием, — регуляторов роста растений (РРР). Нами [311] было изучено влияние на ризобии некоторых синтетических (ивин), природных (эмистим С) и композиционных (агростимулин, биолан) РРР. Изучение влияния РРР ивина, эмистима С, агростиму лина и биолана на накопление биомассы клубеньковыми бактериями сои показало, что штаммы B. japonicum УКМ В-6035 и B. japonicum 21110 по-разному реагировали на присутствие в питательной среде указанных веществ.

Азотфиксирующие микроорганизмы в микробно-растительных системах У высокоэффективного штамма наибольший прирост биомассы, превышающий показатель контроля в 2,2 раза, наблюдали в опыте при внесении синтетического препарата ивина (рис. 37). Этот эффект отмечен при культивировании штамма с наименьшей из исследуемых концентраций ивина — 0,1 пл/мл.

рис. 37. Влияние ивина ( ) и эмистима С ( ) на накопление биомассы B. japonicum УКМ В- Влияние РРР природного происхождения эмистима С на рост B. japonicum УКМ В-6035 было несущественным при любой концен трации. Значительного прироста биомассы при культивировании штамма с данным РРР не выявлено. Такой эффект может быть связан с тем, что штамм продуцирует собственные биологически активные вещества, которые в суммарной с РРР концентрации могут не толь ко стимулировать, но и угнетать рост микроорганизмов.

В опытах с композиционным препаратом агростимулином (эмистим С + ивин) наблюдали прирост биомассы во всём диапа зоне использованных концентраций (рис. 38). Максимальный прирост биомассы ризобий составлял 57 % при концентрации препа рата 1 пл/мл.

рис. 38. Влияние агростимулина ( ) и биолана ( ) на накопление биомассы B. japonicum УКМ В- Другой композиционный препарат биолан (эмистим С + микро элементы) в диапазоне исследованных концентраций способствовал повышению биомассы B. japonicum УКМ В-6035 на 74—91 %. При концентрации 10 пл/мл максимальный прирост биомассы бактерий более чем в 4 раза превышал результаты, которые были получены при внесении эмистима С.

Характер влияния РРР на малоэффективный штамм B. japonicum 21110 несколько отличался (рис. 39): под влиянием эмистима С макси мальный прирост биомассы (68 % по сравнению с контролем) наблю дали при наименьшей концентрации — 0,1 пл/мл. В присутствии ивина максимальное накопление биомассы, которое превышало контроль на 34 %, получено при концентрации данного вещества 1 пл/мл.

рис. 39. Накопление биомассы B. japonicum 21110 под влиянием регуляторов роста растений ивина ( ) и эмистима С ( ) При культивировании малоэффективного штамма B. japonicum 21110 с агростимулином увеличение биомассы (на 22 % по сравнению с контролем) было получено при наименьшей концентрации регуля тора в среде — 0,1 пл /мл (рис. 40).

В условиях проведённого опыта мы не только не наблюдали позитивной реакции штамма B. japonicum 21110 на биолан, но и отметили угнетение роста культуры на 38—39 % по сравнению с контролем.

Таким образом, из всех испытанных регуляторов роста растений только ивин и агростимулин способствовали повышению выхода биомассы обоих штаммов B. japonicum. Это может быть связано со способностью ивина, который также входит в состав агростимулина, влиять на проницаемость клеточных мембран ризобий и стимулиро вать активный и пассивный транспорт ионов [428].

Азотфиксирующие микроорганизмы в микробно-растительных системах рис. 40. Накопление биомассы B. japonicum 21110 под влиянием регуляторов роста растений агростимулина ( ) и биолана ( ) Параллельно изучали влияние ивина и эмистима С на накопле ние ЭПМ ризобиями сои, которые отличаются по активности азот фиксации в условиях симбиоза. В контроле без фиторегуляторов высокоэффективный штамм B. japonicum УКМ В-6035 синтезировал ЭПМ в незначительном количестве, в результате чего их продукция была в 49—245 раз меньше, чем у малоэффективного штамма B. japonicum 21110 (рис. 41).

рис. 41. Продуцирование экзополимеров штаммом B. japonicum УКМ В- в условиях культивирования в присутствии регуляторов роста растений ивина (а) и эмистина С (б) При культивировании эффективного штамма с синтетическим препаратом ивином отмечено снижение синтеза ЭПМ при всех концен трациях на 17,3—80,4 % (см. рис. 41, а). Применение природного РРР эмистима С также приводило к снижению продуцирования ЭПМ эффективным штаммом УКМ В-6035 на 10—71 % (см. рис. 41, б).

В опытах с малоэффективным штаммом B. japonicum 21110 было отмечено повышение накопления ЭПМ под влиянием ивина и эмистима С (рис. 42).

Ивин стимулировал продуцирование экзополимеров этим штам мом на 13—270 % (см. рис. 42, а). Наибольший синтез (в 3,7 раза по сравнению с контролем) отмечен при применении ивина в концен трации 1 пл/мл. Природный РРР эмистим С в диапазоне концентра ций 1—10 пл/мл способствовал увеличению удельной продукции экзополимеров у малоэффективного штамма на 27—45 % по сравне нию с контролем (см. рис. 42, б).

рис. 42. Продуцирование экзополимеров малоэффективным штаммом B. japonicum 21110 в условиях культивирования в присутствии регуляторов роста растений ивина (а) и эмистима С (б) Для определения роли РРР в физиологической активности ризо бий необходимо было изучить влияние флавоноидов даидзеина и кверцетина, а также РРР ивина и эмистима С на моносахаридный состав ЭПС микросимбионтов сои. Нами изучены моносахаридный состав и молекулярно-массовые характеристики ЭПМ ризобий сои B. japonicum УКМ В-6035 и 21110, отличающихся симбиотическими свойствами (табл. 28, 29) [307].

Известно, что при различных условиях культивирования основная углеводная цепь полисахарида остаётся практически неизменной, а Азотфиксирующие микроорганизмы в микробно-растительных системах Таблица 28. моносахаридный состав экзополимеров B. japonicum под влиянием фиторегулирующих веществ Таблица 29. молекулярно-массовые характеристики экзополимеров клубеньковых бактерий сои под воздействием фиторегулирующих * Молекулярная масса наибольшее изменение испытывают его боковые цепи [485, 920].

Показано, что все ЭПМ исследуемых ризобий сои содержат нейтраль ные углеводы: глюкозу (27—70 %), галактозу (3,7—13 %), маннозу (7—30 %), а также не идентифицированые сахара (см. табл. 28). Это подтверждает данные других авторов [713, 485, 947, 948] о том, что основное олигосахаридное звено кислого ЭПС медленнорастущих клубеньковых бактерий сои состоит из нейтральных сахаров: глюко зы, галактозы и маннозы в соотношении 2:1:1.

Нами получено несколько другое соотношение моносахаридных компонентов в ЭПМ. В полимерах высокоэффективного штамма молярное соотношение глюкозы, галактозы и маннозы в контроле составляло 5:1:1, в варианте с ивином — 6:1:1, с даидзеином — 5:1:2.

У неэффективного штамма — в контроле 6:1:1, в варианте с ивином, эмистимом С и даидзеином — 7:1:1.

Лишь при культивировании ризобий с флавоноидом кверцетином экзополимерный комплекс состоял из нейтральных сахаров в другом соотношении. Их соотношение составляло 11:1:2 для B. japonicum УКМ В-6035 и 5:1:5 — для B. japonicum 21110. Сходные данные моно сахаридного состава ЭПМ исследуемых штаммов свидетельствуют об общности или большом подобии отдельных структурных фрагментов в макромолекулах ЭПМ B. japonicum. Разница в молярном соотноше нии компонентов ЭПМ указывает на существование в них структур ных отличий, которые приводят к индивидуализации полисахаридных соединений.

Результаты исследований по определению молекулярно-массовых характеристик ЭПМ B. japonicum УКМ В-6035 и B. japonicum под влиянием фиторегулирующих веществ представлены в табл. 29.

По данным аналитического центрифугирования, все исследованные ЭПМ B. japonicum характеризуются полидисперсностью, или гете рогенностью. Все ЭПМ содержат 6—7 компонентов, которые принад лежат как к низко- (до 20 кДа), так и к высокомолекулярным (110—500 кДа) фракциям.

Во всех препаратах экзогликанов исследованных клубеньковых бактерий сои преобладают компоненты от 40 до 110 кДа. У B. japonicum УКМ В-6035 содержание фракций с молекулярной массой (м. м.) кДа составляет 15,9—20,4 %, с м. м. 70 кДа — 12,8—25,2 % и с м. м. 110 кДа — 6,2—23,2 %. У B. japonicum 21110 тоже преоб ладают фракции с м. м. 40—110 кДа (13,5—28 %). Сравнение средней м. м. штаммов разной эффективности показывает, что у B. japonicum УКМ В-6035 она была в 2,3 раза ниже, чем у B. japonicum 21110. М.

м. исследованных ЭПМ клубеньковых бактерий сои, вероятно, явля ется штаммовой особенностью.

В составе ЭПМ эффективного штамма УКМ В-6035 общее содер жание фракций с м. м. до 2 · 103 кДа было достаточно высоким (71—94 %), а наивысшим оно было под действием кверцетина.

Азотфиксирующие микроорганизмы в микробно-растительных системах У малоэффективного штамма B. japonicum 21110 общее содержание фракций с м. м. до 2 · 103 кДа также было высоким — 70—87 %, а наивысшим — под действием эмистима С.

Установлено, что исследованные фиторегулирующие вещества повышают среднюю м. м. ЭПМ B. japonicum УКМ В-6035, которая колеблется в пределах 128,2—227,5 кДа по сравнению с контролем (93 кДа). Наибольшие значения м. м., превышающие контроль в 2,2—2,5 раза, были при применении РРР ивина и эмистима С. Флавоноиды даидзеин и кверцетин тоже увеличивали м. м. ЭПМ в 1,6—1,4 раза соответственно.

Результаты действия флавоноидов и РРР на молекулярно массовые характеристики малоэффективного штамма B. japonicum 21110 несколько другие. Средняя м. м. ЭПМ колебалась в пределах 111—305 кДа. Только под действием флавоноида кверцетина значение средней м. м. увеличивалось в 1,4 раза по сравнению с контролем.

Все другие применённые вещества способствовали уменьшению м.

м. ЭПМ опытного штамма в 2 раза.

Формирование симбиотической системы Вторым этапом формирования симбиотической системы явля ется инфекция и развитие клубеньков (рис. 43). В месте резкого сгиба волоска пектолитические ферменты бактерий разрушают рис. 43. Схема образования клубенька на корне бобового растения (по В. Торнтону) [350]:

1 — инфицированный корневой волосок;

2 — инфекционная нить;

3 — деля щиеся клетки корня;

4 — эндодерма;

5 — центральный цилиндр корня;

6 — ксилема клеточную стенку корня, через которую ризобии проникают внутрь.

Вокруг этих бактерий образуется полость — инфекционная нить, стенки которой выстланы растительными клетками, а внутреннее пространство заполнено полисахаридами растения и микросимби онта [350, 752, 753, 925].

Наиболее интенсивное внедрение клубеньковых бактерий в корневые волоски происходит на ранних этапах развития растения.

Нередко оно продолжается и после того, как клубеньки сформиро вались на корнях. Эта избыточная, или дополнительная инфекция происходит потому, что инфицирование волосков не прекращается длительное время. В более поздние сроки заражения клубеньки обыч но размещаются ниже по корню.

Началом инфекционной нити служит место проникновения отдельной клетки или группы клеток. Не исключено, что колония бактерий начинает формироваться ещё на поверхности корня до момента внедрения в него бактерий.

На примере сесбании (Sesbania rostrata L.) показано, что микро симбионт A. caulinodans проникает в растение путём формирования наружного кортикального инфицирующего очага обитания, процесс формирования которого сопровождается образованием перекиси водорода (Н2О 2). Повышенное образование ЭПС на ранних стадиях инвазии предотвращает включение перекиси водорода внутрь бакте рий [687].

А. К. Глянько и соавт. [109] проанализировали один из возмож ных физиологических механизмов бобово-ризобиального симбиоза.

Он заключается в регуляции макросимбионтом интенсивности окис лительных процессов в ответ на заражение ризобиями. В основу анализа положены результаты по содержанию активных форм кисло рода (О2, Н2О2), активности антиоксидантных ферментов (суперок сиддисмутазы, каталазы, пероксидазы), интенсивности перекисного окисления липидов с участием липофильных фенольных соединений, выделяемых макросимбионтом. В зонах корней сортов, восприимчи вых к ризобиям (с хорошей нодуляцией) увеличивается содержание индолил-3-уксусной кислоты на фоне более низкой пероксидазной активности. Таким образом, одним из звеньев механизма нодуляции корней гороха может быть изменение активности пероксидазы, связанной с гормональным статусом корня [6].

Образование клубенька может происходить по-разному. У Pisum, Medicago, Trifolium, Vicia и Cicer формируются недетерминированные клубеньки. В этом случае меристема продолжает делиться на протя жении всего периода существования клубенька, вследствие чего зрелый недетерминированный клубенёк проходит все стадии развития Азотфиксирующие микроорганизмы в микробно-растительных системах (рис. 44). Напротив, детерминированные клубеньки, образующиеся у Glycine, Vigna и Phaseolus, развиваются раздельно во времени, а не в пространстве [1105].

Недетерминированные клубеньки удлиняются и формируют апикальную меристему, лишённую инфицированных клеток. Орга низация симбиотических клеток растения внутри таких клубеньков имеет характерные свойства: клетки растения инфицированы около апекса, фиксируют азот в центре и содержат стареющие бактерои ды в более старых частях [886]. Детерминированные клубеньки, такие, как у родов Lotus, Glycine, Vigna и Phaseolus, образуются после проникновения ризобий в деформирующуюся часть корне вого волоска. Первые деления клеток, индуцируемых ризобиями, происходят во внешнем кортексе. Меристематические клетки стано вятся инфицированными симбиосомами, которые приводят к коло низации центральной ткани, последующей абортивности их мери стем и сферичности клубеньков [886]. Выделяют и третью форму инфекции — «вхождение в щель», при которой ризобии входят интерцеллюлярно в точку появления латеральных корней. Такая форма инфекции выявлена у родов Arachis, Stylosanthes, Andira и Neptunia [886].

Бактерии, внедрившиеся в молодой корневой волосок, в виде инфекционных нитей прорастают вдоль волоска, как бы перетекают в тетраплоидные клетки коры и вызывают их быстрое деление (рис.

45). Они заполняют своим содержимым внутреннее пространство растительных клеток.

Далее происходит эндоцитоз ризобий из инфекционной нити внутрь клеток растения-хозяина. В цитоплазме растительной клетки бактерии окружают перибактероидные мембраны (ПБМ), синтези руемые в основном растительной клеткой и частично ризобиями [107]. Количество ризобиальных клеток внутри ПБМ зависит от вида растения: 5—10 — у вигны, фасоли и сои, по одной — у гороха, люцерны и клевера. Бактериальные клетки, окружённые общей ПБМ, называются симбиосомой и являются основной структурно функциональной единицей симбиоза [1056].

Большинство бобовых растений образуют внутриклеточный симбиоз с ризобиями, идущий по механизму «двойного эндоцитоза».

Микроорганизмы при этом изменяются: теряют клеточную стенку, изменяют свои размеры, форму и морфологию. Кроме того, все они обволакиваются растительным белком — леггемоглобином. После образования клубеньков ризобии в ПБМ преобразуются в особые симбиотические формы — бактероиды (рис. 46), имеющие в 3—5 раз большие размеры, чем свободноживущие бактерии [1160].

рис. 44. Нодуляция в растениях, которые формируют недетерминированные клубеньки [752]:

A — Nod-фактор, синтезированный S. meliloti (верхняя стрелка указывает на группу ацетилов, добавленную к NodL, а нижняя — на половину липида, его длину и степень насыщенности, который модифицирует NodF и NodE);

B — схематический поперечный разрез корня, указаны градиенты активизирующе го фактора в протоксилеме (градиенты, возможно, определяют, какие корне вые клетки могут стать инфицированны ризобиями);

C — эпидермальная клетка с ядром, место для формирования корневого волоска;

D — эпидермаль ная клетка, инициирующая рост корневого волоска;

E — ризобиальная клетка, связанная с корневым волосом, активизирующим корковые ячейки в ответ на Nod-фактор;

F — непрерывный рост корневого волоска;

G — завивание корне вого волоса благодаря Nod-фактору;

H — инициация инфекционных нитей;

I — растущая инфекционная нить угнетает корневой волосок;

J — слияние инфекционной нити с эпидермальной клеточной стенкой и рост ризобий во внутриклеточном пространстве между эпидермальной и корковой клетками;

K — непрерывный рост инфекционной нити и внешней корковой клетки;

L — увеличенный вид корневого волоска Азотфиксирующие микроорганизмы в микробно-растительных системах рис. 45. Фотография инфекционных нитей в корневом волоске [752]:

а — стрелки указывают на верхушку инфекционной нити и ядра с колонкой цитоплазмы между ними;

б — сформированная инфекционная нить и её верхуш ка — легко видимые рис. 46. Бактероиды Rhizobium в клубеньках бобовых [834] Морфология и число клубеньков строго определяются растением хозяином, что возможно связано с большой энергоёмкостью их обра зования (рис. 47 и 48) [631, 776, 1000].

рис. 47. Схема недетерминированного клубенька (а) и гистохими ческая локализация зоны -галактозидазной активности в клубеньках Vicia hirsu ta (б) [1000]:

SG — зерно крахмала;

CS — центральная часть корня;

VB — пучок сосудов;

Z — зоны клубенька;

WT — дикий тип R. leguminosarum, glnB — R. leguminosarum, несущий ген lacZ По мере формирования симбиоза проявляются такие важные для селекции растений признаки, как азотфиксирующая активность (скорость восстановления N2 в NH4+) и симбиотическая эффектив ность (способность растений интенсивно развиваться, используя симбиотрофное питание азотом). Хотя симбиотическая эффектив ность в основном определяется азотфиксирующей активностью Азотфиксирующие микроорганизмы в микробно-растительных системах рис. 48. Схема детерминированного сферического клубенька (а), гистохимическая локализация зоны -галактозидазной активности в 14-дневных клубеньках ( dpi) Phaseolus vulgaris (б), заражённых R. etli с геном lacZ и 21-дневные клубеньки Phaseolus vulgaris (21 dpi) (в) с in situ локализацией крахмала, уроновых кислот и леггемоглобина [1000]:

CS — центральная часть корня;

SG — зерно крахмала;

VB — пучок сосудов;

PT — периферийная ткань;

IC –инфицированные клетки;

UC — неинфициро ванные клетки клубеньков, она также зависит от совместимости метаболических систем партнёров и отсутствия активных защитных реакций растений на проникновение ризобий [107].

Биологическая фиксация атмосферного азота и ферменты азотного метаболизма клубеньковых бактерий Все ризобиальные микроорганизмы имеют индивидуальные, отли чающиеся от других нитрогеназо-регулирующие схемы. Каждая схема регулируется на уровне транскрипции и посттрансляции белков [784].

Для связывания молекулярного азота необходимы восстановитель ная сила и энергия, которые могут быть получены в процессе фото синтеза, брожения или дыхания. В модельных экспериментах с очищенными компонентами нитрогеназной системы (in vitro) можно доставлять энергию в виде аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ) и восстановительную силу в форме восстановленных пиридинну клеотидов и ферредоксинов, используя переносчиков, содержащих флаводоксин. Затраты АТФ при этом очень высоки. По расчётам для клеток Rhizobium на восстановление одной молекулы азота необ ходимо 25—35 молекул АТФ, т. е. на каждый грамм фиксированно го азота расходуется 3—6 г органического углерода (схема 6). Други ми словами, растение в клубеньки поставляет 30—40 % продуктов фотосинтеза. Примерно половина из них возвращается в надземную часть в виде азотистых соединений.

Для активной работы нитрогеназы необходимы микроаэрофиль ные условия, которые в клубеньке обеспечиваются диффузным барье ром (слой плотно прилегающих друг к другу клеток во внутреннем кортексе) и синтезом леггемоглобина (гемоглобинподобный белок, синтезируемый растительными клетками). Леггемоглобин связывает кислород (O2), транспортирует его к симбиосомам, обеспечивая дыха тельную активность клубеньков. Количество леггемоблобина состав ляет до 30 % белка в клубеньках и придаёт им ярко-розовый цвет.

Леггемоглобин напоминает по своей структуре и функции гемоглобин человека и животных, специализирующийся на транспорте О2 и СО2.

Леггемоглобин расположен в клетках клубеньков, где находятся азот фиксирующие микроорганизмы.

Нитрогеназная активность в клубеньках бобовых растений зави сит от многих факторов. На неё влияют штаммовая специфичность, состав питательной среды и присутствие метаболитов бобовых растений [485]. Важным фактором, влияющим на нитрогеназную активность, является концентрация свободного кислорода в корне вых клубеньках. Максимальная нитрогеназная активность в клубень ках сои наблюдалась в узком диапазоне концентраций кислорода (10—57 нМ). Известно, что при низкой концентрации кислорода нитрогеназная активность лимитируется, а при более высокой — Азотфиксирующие микроорганизмы в микробно-растительных системах Схема 6. фиксация N2 и ассимиляция NH4 внутри клеток корня растений, инфицированных ризобиями [1000] ассимиляция N N-содержащие соединения глутамин ингибируется [863]. Ингибирование нитрогеназной активности в клубеньках бобовых растений наблюдалось при обработке нитратом во время длительного пребывания в темноте, что можно объяснить уменьшением содержания кислорода и ограничением дыхания.

Известно, что нитрат снижает нитрогеназную активность в корне вых клубеньках. Штаммы ризобий, которым свойственно высокое содержание фермента нитратредуктазы, являются менее чувстви тельными к ингибирующему влиянию нитрата [900].

У многих диазотрофов, в том числе и у ризобий, нитрогеназа образуется только тогда, когда она необходима, т. е. при отсутствии подходящего источника связанного азота. Ионы аммония подавляют синтез нитрогеназы. При низкой концентрации аммония его первич ная ассимиляция у большинства микроорганизмов происходит за счёт последовательных реакций, которые катализируются глутаминсинте тазой (ГС;

КФ 6.3.1.2) и глутаматсинтазами (ГОГАТ;

КФ 1.4.1.13, 1.4.1.14 та 1.4.7.1) (схема 7). При этом образуется глутамин, а затем глутамат — центральный метаболит синтеза аминокислот и ряда других биологически активных веществ [891]. Эта система обладает высоким сродством к ионам аммония и поддерживает их концентра цию в клетке на низком уровне. Повышение концентрации ионов аммония в окружении клетки (а тем самым и внутри клетки) подавляет образование ГС, а в результате — и нитроге назы. Реакции, которые катализируются этими ферментами, являются основным путём асси миляции аммония у ризобий [120, 485]. Следует отметить, что ГС, как основной фермент ассимиляции аммония прокариот, имеет ещё одну очень важную функцию — связывание с промоторными участ ками ДНК и активации транскрипции целого ряда генов, в том числе — гена нитрогеназы [153, 901].

Схема 7. Ассимиляция аммония у клубеньковых бактерий Когда концентрация аммония в клетках резко увеличена, в его ассимиляции принимает участие глутаматдегидрогеназа (ГДГ;

КФ 1.4.1.2—4) — фермент, который ассоциирован с циклом трикарбоно вых кислот и катализирует восстановительное аминирование -кетоглутарата (одного из основных интермедиатов цикла трикар боновых кислот) до глутамата [649, 1117].

Известно, что наличие двух множественных молекулярных форм фермента ГС в азотфиксирующей культуре клеток Rhizobium, выра щенных на синтетической среде, обеспечивает образование нитроге назы при отсутствии симбиоза с растениями [153]. R. А. Darrow с соавт. [692] у В. japonicum и R. А. Ludwig [901] у Rhizobium sp. 32Н обнаружили в азотфиксирующей культуре клеток две формы ГС.

Ферменты отличались электрофоретической подвижностью, молеку Азотфиксирующие микроорганизмы в микробно-растительных системах лярной массой и термостабильностью [31, 726]. Активность термо стабильной формы ГС регулируется путём аденилирования деаденилирования [30].

При исследовании ГС Klebsiella aerogenes и K. рneumoniae было показано, что ГС у этих бактерий наряду с каталитической функци ей выполняет также роль дерепрессора синтеза нитрогеназы. Анало гичные данные были получены R. A. Ludwig [901] для термостабиль ной формы ГС у клеток Rhizobium вигны, которые были выращены в искусственных условиях при отсутствии растения-хозяина, но имели азотфиксирующую активность.

Амидный азот глутамина, образующийся благодаря ГС, исполь зуется на синтез азотсодержащих соединений клетки, и, в первую очередь, на синтез глутамата в реакции, катализируемой L-глутаминоксоглутарат аминотрансферазой (ГОГАТ). Фермент впер вые был открыт у бактерий. В наше время известны ферредоксин зависимая ГОГАТ (ФД-ГОГАТ;

К.Ф. 1.4.7.1), НАДФН-зависимая ГОГАТ (НАДФ-ГОГАТ;

К.Ф. 1.4.1.13) и НАДН-зависимая ГОГАТ (НАДН-ГОГАТ;

К.Ф. 1.4.1.14).

ГОГАТ катализирует реакцию восстановительного аминирования 2-оксоглутарата глутамином, используя в качестве донора электронов НАДН, НАДФН или восстановленный ферредоксин.

ГОГАТ является одним из важнейших ферментов первичной ассимиляции аммиака. С ГС этот фермент образует систему, которая катализирует глутаматный цикл ассимиляции аммиака у растений и микроорганизмов. Эта система играет важную роль также в реасси миляции аммиака, который образуется в растениях при фотодыхании [30, 153].

ГОГАТ открыта сравнительно недавно, в 1970 г. Первой была найдена НАДФН-зависимая ГОГАТ у бактерий Aerobacter aerogenes [1117]. Этот фермент есть также у дрожжей и гриба Neurospora crassa [1054], а НАДН и НАДФН-зависимые формы ГОГАТ — у Azorhizobium caulinodans [708].

Показано, что бактериальные НАДН-зависимые ГОГАТ прояв ляют глутаминазную активность;

ферменты E. coli и A. аerogenes сохраняют 2—8 % активности при замене глутамина на аммиак [798, 1117].

Существует три потенциальных пути синтеза глутамата у ризобий:

ГС-ГОГАТ-путь (с использованием глутамина как окислителя и 2-оксоглутарата в качестве субстрата), ГДГ-путь (с использованием аммония как окислителя и 2-оксоглутарата в качестве субстрата) и путь с трансаминацией 2-оксоглутарата.

Нами исследована активность ключевых ферментов ассимиляции аммония у контрастных по симбиотическим свойствам штаммов ризо бий сои B. japonicum УКМ В-6035 и B. japonicum 21110 [309—311].

Результаты проведённых исследований свидетельствуют, что физиологическая роль ГС, ГОГАТ и ГДГ в ассимиляции аммиака у обоих исследуемых штаммов является неравноценной (рис. 49).

рис. 49. Активность основных ферментов азотного обмена у ризобий сои:

— B. japonicum УКМ В-6035;

— B. japonicum Активность ГС значительно более высокая (в 4—46 раз), чем ГДГ и ГОГАТ, поскольку она, очевидно, обеспечивает утилизацию амми ака. При этом следует отметить, что у малоэффективного штамма она несколько выше, чем у высокоэффективного.

Можно сделать предположение, что ГОГАТ и ГДГ являются звеньями, скорость которых лимитируется в системе реакций первич ного усвоения аммония ризобиями. Причём для B. japonicum этот факт более выражен, поскольку активность ГОГАТ была низкой.

Разработка приёмов активации этих ферментов позволит направлен но улучшать условия усвоения азота микросимбионтом и повышать азотный обмен в агрофитоценозах.

Кроме того, подобные исследования могут служить основой для селекционного отбора штаммов диазотрофов с высокой интенсивно стью ключевых цепей азотного обмена.

Азотфиксирующие микроорганизмы в микробно-растительных системах Соотношение активности ГС и ГОГАТ, которые рассматривают ся в литературе как тандем ферментов, занимающих ключевую пози цию в усвоении микроорганизмами и растениями амидного азота, показывает, что эта последовательность реакций является только частью тех многочисленных, сопряжённых с ГС, реакций, которые существуют в клетке. Известно, что амидный азот глутамина исполь зуется в синтезе ряда важных азотсодержащих соединений клетки:

пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов, карбамоилфосфата, глюкозамин-6-фосфата, ряда аминокислот, циано кобаламина (вит. В12) и др.

Известно, что активность глутаминсинтетаз микроорганизмов проявляется в присутствии катионов двухвалентных металлов, особен но катионов Mn2+ и Mg2+ [630, 700]. Эта особенность характерна и для ГС ризобий [153, 218, 589, 971]. По данным некоторых авторов глутаминсинтетазы некоторых энтеробактерий и азоспирилл имеют два сайта связывания катионов металлов в активном центре. Если оба сайта связываются с ионами одного металла, происходит гомо биядерный катализ, с ионами двух разных металлов — гетеробиядер ный [31, 831]. Мы изучали возможность существования такого явле ния у исследуемых штаммов ризобий.

Выявлено, что уровень активности фермента в бесклеточных экстрактах ризобий сои во всех исследуемых вариантах был высок (рис. 50). Установлено, что активность данного фермента зависит от субстратного обеспечения культур.

Так, из приведённых на рис. 50 данных видно, что активность ГС ризобий сои, выращенных на среде Исварана, была в 2,6—4, раза выше, чем на среде Райта. Это было обусловлено тем, что при одинаковом солевом составе этих сред первая содержала глюконат кальция и двойное количество дрожжевого экстракта.

В присутствии биолана активность ГС ризобий, которые выра щивали на среде Исварана, была в 1,8—2 раза, а на среде Райта — в 2,4—2,6 раза выше, чем в контроле.

Дальнейшие исследования показали штаммовые отличия чувстви тельности культур ризобий сои к действию РРР. Так, в исследова ниях с синтетическим препаратом ивином активность ГС B. japonicum УКМ В-6035 на разных средах снижалась по сравнению с контролем на 19 и 13 %. Результат действия ивина на активность данного фермента у B. japonicum 21110 был противоположным: в условиях эксперимента она повышалась на 115 и 123 %, а эффективность гетеробиядерного катализа у обоих штаммов была больше, чем гомо биядерного (рис. 51).

рис. 50. Влияние биолана на глутаминсинтетазную активность B. japonicum УКМ В-6035 на разных средах при активации Mn2+ и Mg2+:

рис. 51. Глутаминсинтетазная активность клубеньковых бактерий сои под влиянием ивина при активации Mn2+ и Mg2+:

Азотфиксирующие микроорганизмы в микробно-растительных системах Данные, относящиеся к активности ГС малоэффективного штам ма 21110 в присутствии других исследуемых регуляторов роста расте ний, представлены на рис. 52.

рис. 52. Влияние регуляторов роста растений на глутаминсинтетазную активность B. japonicum 21110 при активации Mn2+ та Mg2+:

— контроль;

Под влиянием РРР эмистима С ферментативная активность существенно не менялась как в присутствии катионов марганца, так и в присутствии катионов марганца и магния. Показатели актив ности ГС были в пределах 700—800 нмоль -глутамилгидроксамата/ (мин · мг белка). Под влиянием биолана активность данного фермен та значительно возросла и превышала контрольный показатель на 86 и 60 %. Максимальные значения ферментативной активности наблюдали при культивировании с композиционным препаратом агростимулином. Активность составляла 1500—1600 нмоль -глутамилгидроксамата/(мин · мг белка) и превышала контрольную на 107 и 88 %. При этом эффективность гомобиядерного катализа на варианте с биоланом была на 16 %, а на варианте с агростиму лином — на 19 % выше, чем гетеробиядерного.

Результаты изучения активности ГС клубеньковых бактерий сои при культивировании с РРР представлены в табл. 30. Под влияни ем эмистима С активность ГС B. japonicum УКМ В-6035 возрастала по сравнению с контролем почти в 1,2—2,2 раза, под влиянием Таблица 30. Активность глутаминсинтетазы клубеньковых бактерий сои под влиянием регуляторов роста растений Регулятор роста растений * Контроль — выращивание без регулятора роста.

биолана — в 1,8—2 раза. Агростимулин и ивин ингибировали иссле дуемую ферментативную активность в 1,5 раза.

Глутаминсинтетаза ризобий в присутствии РРР проявляет разную специфичность к катионам двухвалентных металлов. Максимальное увеличение активности ГС при гетеробиядерном катализе у эффек тивного штамма наблюдали при применении эмистима С, а у мало эффективного — ивина. Стимулирующее действие на активность ГС обоих штаммов ризобий сои отмечено только при культивировании с биоланом (на 60,3—99,6 %).

Изучение активности ГС бесклеточных экстрактов ризобий сои под влиянием некоторых флавоноидов показало, что при внесении в среду исследуемых веществ в дозе, оптимальной для накопления биомассы обоих культур, подтвердились их штаммовые отличия.

В присутствии даидзеина и кверцетина активность ГС высоко эффективного штамма УКМ В-6035 повышалась почти в 2 раза (рис. 53).

Реакция малоэффективного штамма B. japonicum 21110 была прямо противоположной: под влиянием исследуемых флавоноидов активность ГС уменьшалась в 1,2—1,4 раза (рис. 54).

Установлено, что активность ГС бесклеточного экстракта B. japonicum В-6035 в присутствии одного (Mn2+) и двух (Mn2+ и Mg2+) катионов была практически одинаковой (см. рис. 53). У малоэффек тивного штамма 21110 в присутствии в реакционной смеси Mn2+ активность была почти на 20 % выше, чем в присутствии двух катио нов (см. рис. 54). Под влиянием даидзеина эта разница составляла 16 %, а под влиянием кверцетина не была выявлена. Полученные результаты свидетельствуют о том, что у малоэффективного штамма B. japonicum 21110 преобладал гомобиядерный катализ.

Азотфиксирующие микроорганизмы в микробно-растительных системах рис. 53. Активность глутаминсинтетазы B. japonicum В-6035 под влиянием флавоноидов при активации Mn2+ и Mg2+:

— контроль;

— даидзеин;

— кверцетин рис. 54. Активность глутаминсинтетазы B. japonicum 21110 под влиянием флавоноидов при активации Mn2+ и Mg2+:

— контроль;

— даидзеин;

— кверцетин Таким образом, уровень глутаминсинтетазной активности и специфичность этой реакции к ионам двухвалентных металлов (Mn 2+ и Mg 2+) определялся штаммовыми особенностями ризобий сои и природой регуляторов роста растений. Из всех исследуемых фиторегулирующих веществ наибольшее положительное влияние на активность ГС высокоэффективного штамма ризобий сои оказывал даидзеин — основной флавоноидный компонент экссу датов корней сои, а малоэффективного штамма 21110 — синтети ческий РРР ивин.

Исследования в бесклеточных экстрактах ризобий сои другого фермента ассимиляции аммония — глутаматдегидрогеназы — пока зали, что его удельная активность, определяемая при биосинтезе глутамата, не тестировалась в реакции дезаминирования (НАД + зависимая реакция). Подобные данные получены для ГДГ других микроорганизмов и растений, что, возможно, связано с дезактива цией фактора, регулирующего равновесие обратной реакции синтеза глутамата [337, 417, 649].

Высокая активность глутаматдегидрогеназы (рис. 55 и 56) — 457,95—649,37 нмоль НАДН/ (мин·мг белка) — эффективного штамма ризобий сои B. japonicum УКМ В-6035 под влиянием фиторегулирующих веществ указывает на важную физиологическую роль этого фермента в создании и накоплении глутамата в исследуемых условиях.

рис. 55. Активность глутаматдегидрогеназы ризобий сои (B. japonicum) под влиянием флавоноидов:

— B. japonicum УКМ В-6035;

— B. japonicum Азотфиксирующие микроорганизмы в микробно-растительных системах рис. 56. Активность глутаматдегидрогеназы ризобий сои (B. japonicum) под влиянием регуляторов роста растений:

— B. japonicum УКМ В-6035;

— B. japonicum Флавоноиды даидзеин и кверцетин стимулировали активность ГДГ эффективного микросимбионта сои (см. рис. 55). Их использо вали в оптимальной для роста ризобий концентрации: для B. japonicum УКМ В-6035 даидзеин — 1000 нМ, кверцетин — 100 нМ;

для B. japonicum 21110 даидзеин — 0,01 нМ, кверцетин — 100 нМ.

В контроле активность ГДГ составляла 278,32±10,66 НАДН/(мин·мг белка), а при добавлении в среду даидзеина и кверцетина она возрас тала на 133 % и 24 %, соответственно. У штамма 21110 эти флаво ноиды приводили к потере активности ГДГ.

В присутствии в среде РРР ивина наблюдали увеличение актив ности ГДГ обоих штаммов. Однако, если у эффективного штамма УКМ В-6035 удельная активность повышалась почти в 5 раз, то у неэффективного штамма 21110 — лишь в 1,4 раза (см. рис. 56).

Регуляторы роста растений использовали в оптимальной для роста ризобий концентрации: для B. japonicum УКМ В-6035 ивин — 0,1 пл/мл, эмистим С — 10 пл/мл;

для B. japonicum 21110 ивин — 1 пл/мл, эмистим С — 0,1 пл/мл. Эмистим С позитивно влиял на активность ГДГ у B. japonicum УКМ В-6035 и негативно — у B. japonicum 21110.

Так, в первом случае исследуемая ферментативная активность возрас тала в 4 раза, а во втором понижалась на 30 %.

По сравнению с эффективным штаммом, активность ГДГ мало эффективного штамма B. japonicum 21110 под влиянием фиторегули рующих веществ была значительно ниже — от (55,00±4,78) нмоль НАДН/(мин · мг белка) до (169,80±14,68) нмоль НАДН/(мин · мг белка) (см. рис. 55 и 56). Под воздействием эмистима С она была ниже показателей контроля, а под воздействием ивина — выше.

Таким образом, все исследованные фиторегулирующие вещества стимулировали активность ГДГ высокоэффективного микросимбионта сои B. japonicum УКМ В-6035. Позитивное действие на малоэффектив ный штамм ризобий B. japonicum 21110 оказывал лишь ивин;

в других вариантах наблюдали угнетение этой ферментативной реакции.

Экологические и агротехнические факторы, влияющие на эффективность бобово-ризобиального симбиоза Повышение урожайности сельскохозяйственных культур в значи тельной степени зависит от обеспечения их элементами минерально го питания. В большинстве почв доступные растениям азотные соеди нения находятся в незначительном количестве, поэтому вопрос о повышении плодородия почв, прежде всего, связан с обеспечением их азотом. Положительная роль бобовых культур в накоплении азота тесно связана с жизнедеятельностью клубеньковых бактерий. Урожай бобовых культур и накопление ими биологического азота и расти тельного белка в урожае зависят от того, насколько активно образу ется симбиоз [51, 52]. Особенно важно формирование и функциони рование эффективных бобово-ризобиальных систем в агроценозах с высокой антропогенной нагрузкой.

Эффективность бобово-ризобиального симбиоза определяется не только видовыми или штаммовыми особенностями клубеньковых бактерий и чувствительностью растений к инокуляции. Известно, что условия среды и агротехника выращивания бобовых культур играют важную, а нередко и решающую роль в реализации потен циальных возможностей ризобий и формировании их симбиотиче ских взаимоотношений с растениями [22, 397, 745]. Решение вопро са эффективности симбиотической азотфиксации невозможно без основательного изучения факторов, определяющих взаимодействие симбионтов на протяжении всего вегетационного периода. На эффективность бобово-ризобиального симбиоза влияют факторы окружающей среды: температура, влажность почвы, её аэрация, уровень рН, содержание пестицидов, подвижных форм азота, фосфора, калия, микроэлементов, обработка средствами стимуляции роста растений и др. [141, 356, 397, 485].

Согласно наблюдениям, острый недостаток влаги в почве приво дит к отмиранию клубеньков [356]. Минимальная влажность почвы, при которой происходит их развитие, составляет около 15—20 % полной влагоёмкости [397]. Клубеньки у бобовых растений образу Азотфиксирующие микроорганизмы в микробно-растительных системах ются при влажности почвы 40—80 %, а оптимальной является влаж ность на уровне 60—70 % [356]. Тем не менее, переувлажнение почвы также отрицательно влияет на численность ризобий, их активность и эффективность симбиоза [22]. На процесс симбиотической азот фиксации также влияет аэрация почвы, при нехватке которой даже при условии инокуляции растений эффективными штаммами ризобий образуются мелкие клубеньки. Важную роль в формировании бобово ризобиального симбиоза играет температура. Активная азотфиксация и формирование высокого урожая у бобовых растений происходит при температуре 20—24 °С [910]. Образование клубеньков в естествен ных условиях можно наблюдать при температуре немного выше 0° С, но азотфиксации при таких условиях практически не происходит.

С повышением температуры на корнях сои наблюдали увеличение количества клубеньков, их сырой массы и азотфиксирующей актив ности [489]. Многие виды бобовых растений при температуре 30° С связывают молекулярный азот в незначительном количестве, хотя их симбионты при этих условиях могут активно размножаться и обра зовывать клубеньки [356]. Так, при изучении особенностей взаимо действия вики мохнатой и клубеньковых бактерий в различных эколо гических условиях, в частности при низкой температуре, было показано, что между массой корневых клубеньков, численностью клубеньковых бактерий и зимостойкостью вики существует положи тельная коррелятивная связь. Тесная обратная связь наблюдается между числом корневых клубеньков и поражением вики фузариями и мучнистой росой [448].

Отрицательное влияние на развитие симбиотических систем бобовых растений оказывает засоление почвы [1077, 1078] и приме нение средств химической защиты растений от сорняков и вредите лей [361, 1076]. Внесение хлорорганических пестицидов, фунгицидов и других загрязнителей окружающей среды ингибирует образование симбиоза между ризобиями и растениями-хозяевами, снижает обра зование клубеньков, уменьшает нитрогеназную активность, что отри цательно влияет на урожайность растений [745, 969]. Например, под влиянием гербицидов дуала и тилама количество клубеньков умень шалось в 1,5—5 раз, азотфиксирующая активность — в 2 раза и более и существенным образом снижалась урожайность люцерны [243].

Гербициды на основе ацетохлора уменьшали образование клубеньков у сои и снижали эффект нитрагинизации [505]. Отрицательно влия ла на симбиоз также одновременная инокуляция семян и обработка их инсектицидом ометоатом [1076].

Несмотря на большое количество имеющихся публикаций, неод нозначным является ответ на вопрос о целесообразности применения под бобовые культуры азотных удобрений. Одни авторы [125, 509] считают, что необходимо применять большие нормы минерального азота для получения высокого урожая независимо от его влияния на симбиотический аппарат. Другие авторы [342, 408], наоборот, полно стью исключают необходимость внесения под бобовые культуры минерального азота, считая, что при инокуляции семян высокоэф фективными штаммами клубеньковых бактерий и создании оптималь ных условий для макро- и микросимбионтов растения будут полно стью обеспечены симбиотически усвоенным азотом. Есть сведения [9, 144], что применение минеральных азотных удобрений под бобо вые культуры в разных почвенно-климатических зонах Украины не даёт желательного результата. Внесение «стартовой» дозы азота (30— кг/га) только задерживает образование клубеньков и снижает их нитрогеназную активность, так как запас питательных веществ в семядолях и значительное количество нитратного азота в пахотном пласте почвы обеспечивают хорошее развитие растений на этапе до начала образования и активного функционирования клубеньков.

Применение же фосфорных и калийных минеральных удобрений положительно влияет на формирование и функционирование растительно-микробного симбиоза. И. В. Синявский и соавт. [473] представили результаты изучения влияния минеральных удобрений на формирование биомассы и азотфиксирующую активность симби отического аппарата люцерны. Максимально азотфиксирующая актив ность клубеньков люцерны реализовалась при Р180 и Р90 К105. Урожай воздушно-сухой массы составил соответственно 7,06 и 8,7 т/га.

Известно, что эффективность процесса биологической азотфик сации, в том числе и симбиотической, составляет 20—350 кг азота/га в год в зависимости от вида растения и ряда факторов, лимитирующих активность корневых диазотрофов [485]. Производительность этого процесса может быть существенным образом повышена. Выделяют несколько путей усиления биологической азотфиксации [397]:

• увеличение потенциала азотфиксирующей активности в корне вой зоне растения в результате изменения его генотипа;

• повышение реализации потенциала азотфиксации благодаря инокуляции сельскохозяйственных культур активными штаммами диазотрофов и другими ростстимулирующими ризобактериями, внесе нию в почву оптимальных доз минерального азота, применению микроэлементов, регуляторов роста растений и т.п.

Предпосевная инокуляция и применение регуляторов роста расте ний, кроме усиления процесса азотфиксации, способствуют повы шению коэффициента использования химических удобрений, что ставит эти мероприятия в ряд экологически и экономически важных Азотфиксирующие микроорганизмы в микробно-растительных системах элементов в технологии выращивания сельскохозяйственных культур [88, 246].

Таким образом, повышение реализации потенциала биологичес кой азотфиксации может существенным образом увеличить произво дительность агроценоза при одновременном выполнении требований охраны окружающей среды.

Ассоциативные и свободноживущие диазотрофы Многочисленными исследованиями [87, 330, 397, 517, 518, 704—706] доказано широкое распространение явления азотфиксации в фитоплане (на поверхности надземной части и корня) небобовых растений. Такой тип азотфиксации, в отличие от симбиотической, Термином «ассоциативные» объединяют микроорганизмы, взаи модействие которых с растениями не приводит к формированию специализированных структур (типа клубеньков), однако характери зуется синтезом специфических образований (пилей, фимбрий, адге зинов), способствующих прикреплению бактерий к корням растений, а также проникновению их в межклеточные пространства и клетки кортекса корней. Фимбрии и пили представляют собой нитевидные клеточные придатки диаметром 3—10 нм, варьирующие по длине.

Они построены из белковых субъединиц, формирующих спиралевид ную трубчатую органеллу. Наличие таких фибриллярных придатков обеспечивает микроорганизмам прикрепление к поверхностям, несу щим тот же заряд, что и клеточная стенка [480]. Прикрепление клеток, необходимое для образования плёнок, осуществляется с помо щью адгезинов — полисахаридов и поверхностных белков [690].

Явление ассоциативности детерминировано генетическим аппа ратом партнёров. Такими генетическими детерминантами у бактерий могут быть гены азотного обмена, синтеза фитогормонов и других биологически активных веществ, гены подвижности и хемотаксиса, структурных элементов клеточной стенки и др. [220, 357].

Формирование ассоциации включает несколько стадий: хемотак сис к корням, прикрепление и «заякоривание» на них, зачастую с образованием фибриллярного слоя вокруг бактерий, проникновение бактерий внутрь корня и колонизация межклеточного пространства между эпидермисом и кортексом (иногда проникновение внутрь кортекса) [209]. Бактерии заселяют различные органы растений, каждый из которых представляет особую эконишу. Предложены термины, определяющие каждую из этих экониш: филлосфера — зона, прилегающая к наземным частям растений, р и з о с ф е р а — зона корневой системы, г е м и с ф е р а — почки, с п е р м о с ф е р а — семена.

Также отдельными терминами выделяют ф и л л о п л а н у — поверхность листьев и р и з о п л а н у — поверхность корней. Освоение микроор ганизмами экониш фитосферы (рис. 57) связано с их поселением на поверхности (эпифиты) и с внедрением в ткани растений (эндо фиты) [666].

рис. 57. Распределение диазотрофов Klebsiella pneumoniaе 2028 в тканях стебля (а) и на поверхности корня кукурузы (б), коло ни зированных бактериями Klebsiella pneumoniaе 2028, мечеными разными флуоресцирующими белками. Длина масштабной метки — 20 мкм [666] Часто наблюдается накопление азотфиксирующих бактерий в ризосфере растений, растущих на почве с недостатком азотсодержа щих питательных веществ.

К ассоциативным азотфиксаторам относят представителей родов Azospirillum, Azotobacter, Beijerinckia, Klebsiella, Agrobacterium, Clostridium, Acetobacter, Enterobacter, Pseudomonas, Herbaspirillum, Burkholderia, Campylobacter, Xanthomonas, Flavobacterium, Derxia и др. [138, 397, 560].

Все они — грамотрицательные протеобактерии. Среди грамположи тельных бактерий типичными обитателями фитосферы, участвующи ми в процессе разложения растительных остатков, являются Artrobacter, Bacillus, Rhodococcus, Promicromonospora, Cellulomonas, некоторые спороактиномицеты и др.

Наиболее основательно изучены представители рода Azospirillum, которые обнаружены в ассоциации с различными злаковыми и кормо Азотфиксирующие микроорганизмы в микробно-растительных системах выми травами [220, 357, 706]. С помощью световой и электронной микроскопии установлено проникновение азотфиксирующих бактерий рода Azospirillum, Azotobacter, Derxia, Klebsiella, Rhizobium, Azorhizobium внутрь растительных клеток корня и существование их как стабиль ной популяции [673, 675, 968].

М. И. Чумаков и соавт. [539] показали, что агробактерии, явля ясь мезофильными обитателями почвы, могут существовать и как фитопатогены, и как ассоциативные партнёры растения. Агробакте рии относят к ассоциативным микроорганизмам по следующим признакам: активность азотфиксации, синтез фитогормонов, адсорб ция на корнях и колонизация корневой системы и др. Однако меха низмы формирования ассоциации агробактерий с растениями оста ются мало изученными.

Кроме того, диазотрофы способны к азотфиксации вне растения.

Известно более 30 видов микроорганизмов-азотфиксаторов, суще ствующих в почве как свободноживущие хемоорганогетеротрофы, или фототрофы. К ним относятся грамотрицательные аэробы — пред ставители родов Azotobacter, Azomonas, Beijerinckia;

грамотрицательные факультативно-анаэробные энтеробактерии — Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumonia, Citrobacter intermedius, Xanthobacter flavus;

грампо ложительные спорообразующие аэробные бациллы (Paenibacillus polymyxa, Bacillus macerans) и анаэробные клостридии (Clostridium (С.) pasterianum, C. butiricum, C. acetobutiricum, C. pectinovorum), а также одноклеточные и многоклеточные фототрофные цианобактерии.

Общие масштабы биологической фиксации азота на планете составляют 175—324 млн тонн азота в год и в целом превосходят вклад в сельское хозяйство химических азотных удобрений [560]. Но на единицу площади сельскохозяйственных угодий уровень азотфик сации недостаточен для обеспечения необходимых урожаев. В наибольших масштабах азот фиксируется в ходе ассоциативной азот фиксации [517, 704]. По мнению L. К. Porter [1016], вклад несим биотических азотфиксаторов в азотный баланс почв в разных экоси стемах составляет от 2—4 кг N2/га до 540 кг N2/га в год. По оценкам Е. Н. Мишустина и соавт. [354], сделанным на основе многолетних исследований, эта величина составляет 50—80 кг N2/га в год. В биоге оценозах зоны умеренного климата масштабы ассоциативной азот фиксации могут достигать размеров 30—50 кг N2/га за вегетационный период, а в тропической зоне — 100 кг N2/га [518].

По данным В. Ф. Патыки и соавт. [396, 397, 400], продуктивность азотфиксации под озимой пшеницей на юге Украины может достигать 60 кг N2/га в год, под просом — 40 кг N2/га в год, а под ячменём в условиях Черниговского Полесья — также около 40 кг N2/га в год.

Диазотрофные микроорганизмы как составляющая микробного комплекса фитосферы высших растений структура диазотрофного сообщества деляются многими факторами: почвенно-климатической зоной, влаж ностью среды обитания, аэрацией, типом биогеоценоза (болото, лес, луг, агроценоз), временем года, погодными условиями, возрастом растения, растительными метаболитами. При этом следует учитывать, что результаты исследований зависят от методики отбора и анализа образцов, состава сред, используемых для анализа. В одной и той же климатической зоне различия между бактериальными комплек сами разных почв зависят, в первую очередь, от количества влаги и типа фитоценоза. Меньшее значение имеет рН и температура, хотя для некоторых диазотрофов это имеет определяющее значение.

Так, азотобактер предпочитает почвы с нейтральным рН, а в кислых верховых торфяниках обитает другой активный азотфиксатор — Beijerinckia [138].

Растения регулируют суточную и сезонную динамику азотфик сирующих бактерий в ризосфере за счёт веществ, выделяемых в почву с корневыми экссудатами. Наиболее тесно связаны с растениями протеобактерии, среди которых преобладают диазотрофы, способные к факультативному и облигатному эндосимбиозу с растениями.

Хотя растение-хозяин оказывает более сильное влияние на состав диазотрофного сообщества, ассоциированного с корнями, по сравне нию с абиотическими факторами [865], вопрос приуроченности опре делённых видов диазотрофов к тем или иным видам растений явля ется дискуссионным [517, 518].

На корнях тропических злаков преобладают Azotobacter paspalii, Beijerinckia indica, Azospirillum brasilense и Azospirillum lipoferum [705].

В ризоплане сахарного тростника наряду с этими видами среди доми нантов обнаружены представители Derxia, Clostridium и Vibrio.

R. Larson и J. Neal [867] в корневой зоне зерновых культур наблю дали доминирование Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloaceae, Erwinia herbicola, Spirillum sp., Bacillus sp. Наиболее распространенными и многочисленными в ризосфере озимой ржи являются гетеротрофные аэробные диазотрофы родов Azotobacter, Azospirillum, Bacillus, Pseudomonas и анаэробные гетеротрофы рода Clostridium [330].

В зоне корней риса в природных условиях складывается особое ризосферное сообщество в связи с выращиванием в заливаемых водой почвах. Оно состоит из анаэробных фототрофных бактерий и циано Азотфиксирующие микроорганизмы в микробно-растительных системах бактерий — представителей родов Rhodospirillum, Rhodomicrobium, Rhodopseudomonas, Rhodobacter [372]. Диазотрофы рода Azoarcus способ ны образовывать эндофитную ассоциацию с корнями риса, проникая в кортекс, везикулярную систему, ксилему и корневые волоски [1038].

При инокуляции корней пшеницы Azorhizobium caulinodans, выде ленными из стеблевых и корневых клубеньков тропических бобовых растений, формировалась эндофитная ассоциация азоризобий с корнями пшеницы [1062]. При этом повышалась нитрогеназная актив ность ассоциации. Эндоризосферная ассоциация образовывалась также на корнях риса и пшеницы бактериями родов Acetobacter и Herbaspirillum, выделенными из корней сахарного тростника [842].

биоразнообразие в экосистемах сообществ в различных эконишах, в том числе в фитосфере. Особый интерес представляют азотфиксирующие прокариоты, играющие веду щую роль в цикле азота.

Изучение разнообразия диазотрофных бактерий в различных почвах показало, что в кислой лесной дерново-подзолистой почве доминирующей группой азотфиксаторов являются энтеробактерии E. aeroginosa, K. pneumoniae, Citrobacter intermedius [207]. Азотфикса ция возрастала в ряду: почва под ельником почва под берёзами и липами окультуренная почва. В пахотных почвах доминирова ли клостридии. В засоленной такыровидной почве преобладали солеустойчивые виды Xanthobacter flavus и Alcaligenes paradoxus [272], в затопляемой — сульфатредуцирующие бактерии. В тропических почвах были найдены, главным образом, азоспириллы [705, 707].

Однако эти ассоциативные диазотрофы широко распространены и в ризосфере сельскохозяйственных растений умеренных широт [87, 89, 90, 579, 782].

Спектр известных диазотрофных бактерий постоянно пополня ется. Долго считалось, что функция азотфиксации свойственна лишь некоторым свободноживущим бактериям — Azotobacter, Clostridium, Azospirillum, Beijerinckia, Derxia. Е. Н. Мишустин и соавт.

[352] установили, что в целинных лесных почвах большую роль в фиксации азота из атмосферы играют факультативно-анаэробные бактерии, такие, как энтеробактерии, а в окультуренных почвах южной зоны — бактерии рода Xanthobacter.

В настоящее время способность к фиксации азота из атмосферы установлена у представителей большинства таксономических групп бактерий и архей, за исключением мицелиальных актиномицетов, у которых не обнаружена нитрогеназа (кроме франкий, образующих симбиоз с корнями многих небобовых растений). Среди аэробных диазотрофов франкии выделяются высокой степенью устойчивости процесса азотфиксации к кислороду и приближаются по этому показа телю к цианобактериям, образующим гетероцисты [138]. У термофиль ного актиномицета S. thermoautotrophicus установлено наличие уникаль ной нитрогеназы с высокой эффективностью использования энергии и способностью функционировать в аэробных условиях, т. е., в отличие от ранее известных типов нитрогеназ, она не ингибируется молекуляр ным кислородом [1043]. Другие представители актиномицетов характе ризуются слабой азотфиксирующей активностью [518, 520].

С применением полимеразной цепной реакции (ПЦР) и метода ацетиленовой редукции доказано, что способность фиксировать атмосферный азот свойственна метанотрофам всех трёх известных морфотипов [71, 104, 597]. Большинство метанотрофов обладают двумя основными типами развитых внутрицитоплазматических мембран (ВЦМ), которые коррелируют с рибулозомонофосфатным (РМФ) и сериновым путями С-1-ассимиляции (схема 8).

Такая структурно-функциональная корреляция, возможно, связа на с разной энергоёмкостью этих путей и различной эффективностью энергетических процессов, происходящих на мембранах I и II типов [791]. Представители Х морфотипа (бактерии родов Methylococcus и Methylocaldum), кроме ферментов рибулозомонофосфатного и сери нового путей обладают ключевыми ферментами цикла Кальвина, которые, как предполагают, нужны для сброса избыточной метабо лической энергии и поддержания энергетического статуса клеток при повышенной температуре [159].

Метанотрофные бактерии (рис. 58) — постоянные обитатели филлосферы и ризосферы, поскольку метанол является продуктом метаболизма растений или распада растительных тканей под действи ем пектинметилэстеразы, а метан повсеместно присутствует в приро де. Эти бактерии могут успешно конкурировать с другими микро организмами, ассоциированными с растениями.

При микроскопировании среди метанотрофов обнаруживают различные формы: палочки, клетки изогнутой и округлой формы.

Изогнутые формы более характерны для метанотрофов II морфотипа.



Pages:     | 1 |   ...   | 3 | 4 || 6 | 7 |   ...   | 17 |
 




Похожие материалы:

«Отдел по церковной благотворительности и социальному служению Русской Православной Церкви Региональная общественная организация поддержки социальной деятельности Русской Православной Церкви Милосердие Е.Б. Савостьянова Как организовать помощь кризисным семьям в сельской местности Опыт Курской областной организации Центр Милосердие Лепта Книга Москва 2013 1 УДК 364.652:314.6(1-22) ББК 60.991 С13 Серия Азбука милосердия: методические и справочные пособия Редакционная коллегия: епископ ...»

«Орловская областная публичная библиотека им. И. А. Бунина БИБЛИОТЕЧНО- ИНФОРМАЦИОННОЕ ПОЛЕ АГРАРИЕВ Орел 2010 ББК 78.386 Б 59 Библиотечно-информационное поле аграриев : методико-информацион- ный сборник / Орловская обл. публ. б-ка им. И. А. Бунина ; [сост. Е. А. Су- хотина]. – Орел : Издатель Александр Воробьёв, 2010. – 108 с. В настоящее время наблюдается резкое увеличение интереса специалистов агро промышленного комплекса к проблемам использования возможностей информационно коммуникационных ...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования КРАСНОЯРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПЕДАГОГИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ им. В.П. Астафьева ПОЛЕВАЯ БОТАНИКА МОРФОЛОГИЯ И СИСТЕМАТИКА ЦВЕТКОВЫХ РАСТЕНИЙ. ОСНОВЫ ФИТОЦЕНОЛОГИИ Учебное пособие Электронное издание КРАСНОЯРСК 2013 ББК 28.5я73 УДК 58 П 691 Составитель: Н.Н. Тупицына, доктор биологических наук, профессор Рецензенты: А.Н. Васильев, доктор ...»

«Департамент культуры города Москвы Государственный Дарвиновский музей КАТАЛОГ КОЛЛЕКЦИИ РЕДКАЯ КНИГА БОТАНИКА Москва 2013 ББК 79л6 К 95 Государственный Дарвиновский музей Составители: заведующая сектором Редкая книга В. В. Миронова, старший научный сотрудник Э. В. Павловская, заведующая справочно-библиографическим отделом О. П. Ваньшина Фотограф П. А. Богомазов Редакторы: Н. И. Трегуб, Т. С. Кабанова Каталог коллекции Редкая книга. Ботаника / cост. В. В. Миронова, Э. В. Павловская, О. П. ...»

«С.-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ В. С. ИПАТОВ, Л. А. КИРИКОВА ФИТОЦЕНОЛОГИЯ Рекомендовано Министерством общего и профессионального образования Российской Федерации в качестве учебника для студентов высших учебных заведений, обучающихся по направлению и специальности Биология САНКТ-ПЕТЕРБУРГ ИЗДАТЕЛЬСТВО С.-ПЕТЕРБУРГСКОГО УНИВЕРСИТЕТА 19 9 7 УДК 633.2/3 И76 Рецензенты: д-р биол. наук В. И. Василевич (БИН РАН), кафедра бо таники и экологии растений Воронежского университета (зав. ...»

«Петра Ньюмейер – Натуральные антибиотики ЗАЩИТА ОРГАНИЗМА БЕЗ ПОБОЧНЫХ ЭФФЕКТОВ МИР КНИГИ ББК 53.52 Н92 Petra Neumayer NATRLICHE ANTIBIOTIKA Ньюмейер, Петра Н 92 Натуральные антибиотики. Защита организма без побочных эффектов. / Пер. с нем. Ю. Ю. Зленко — М.: ООО ТД Издательство Мир книги, 2008. — 160 с. Данная книга является уникальным справочником по фитотерапии. Автор простым и доступным языком излагает историю открытия натуральных антибиотиков, приводит интересные факты, повествующие об их ...»

«Министерство сельского хозяйства Российской Федерации ФГБОУ ВПО Вологодская государственная молочнохозяйственная академия имени Н.В. Верещагина Первая ступень в науке 2 часть Сборник трудов ВГМХА по результатам работы II Ежегодной научно-практической студенческой конференции Экономический факультет Вологда – Молочное 2013 ББК: 65.9 (2Рос – в Вол) П 266 Редакционная коллегия: к.э.н., доцент Медведева Н.А.; к.э.н., доцент Юренева Т.Г.; к.э.н., доцент Иванова М.И.; к.э.н., доцент Бовыкина М.Г.; ...»

«И.П. Айдаров, А.И. Корольков ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ КОМПЛЕКСНЫХ МЕЛИОРАЦИЙ В РОССИИ МОСКВА, 2003 1 УДК В книге на основании обобщения результатов многолетних опытно-производственных и теоретических исследований и имеющегося опыта рассмотрены проблемы природопользования в сфере АПК и особенности природно-хозяйственных условий экономических районов. Дан анализ изменения основных свойств природных ландшафтов при трансформации их в агроландшафты. Выявлены причинно-следственные связи, на основании ...»

«Управление по охране окружающей среды Пермской области Пермский государственный университет Пермский государственный педагогический университет Жемчужины Прикамья (По страницам Красной книги Пермской области) Пермь 2003 УДК 574 ББК 28.088 Ж53 ЖЕМЧУЖИНЫ ПРИКАМЬЯ (По страницам Красной книги Пермской области) Издание предназначено для школьников, изучающих биологию и эко- логию в средних школах и лицеях по всем действующим программам, в ка честве регионального материала, а также в учреждениях ...»

«Министерство сельского хозяйства Российской Федерации Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Пермская государственная сельскохозяйственная академия имени академика Д.Н. Прянишникова ИННОВАЦИОННОМУ РАЗВИТИЮ АПК – НАУЧНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ Сборник научных статей Международной научно-практической конференции, посвященной 80-летию Пермской государственной сельскохозяйственной академии имени академика Д.Н. Прянишникова (Пермь 18 ноября 2010 года) Часть ...»

«МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РЕСПУБЛИКИ БАШКОРТОСТАН Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования БАШКИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ООО БАШКИРСКАЯ ВЫСТАВОЧНАЯ КОМПАНИЯ НАУЧНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ УСТОЙЧИВОГО ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ И РАЗВИТИЯ АПК Часть III НАУЧНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ УСТОЙЧИВОГО РАЗВИТИЯ ЖИВОТНОВОДСТВА И ПЧЕЛОВОДСТВА ВЕТЕРИНАРНАЯ НАУКА – ПРОИЗВОДСТВУ Материалы всероссийской ...»

«Министерство сельского хозяйства РФ Департамент научно-технологической политики и образования Министерство сельского хозяйства Иркутской области Иркутская государственная сельскохозяйственная академия Аграрный университет, Краков, Польша Монгольский государственный сельскохозяйственный университет Белорусская государственная сельскохозяйственная академия Казахский национальный аграрный университет ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ БЕЗОПАСНОСТЬ И ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ АГРАРНОГО ПРОИЗВОДСТВА ЕВРАЗИИ Материалы ...»

«МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ АЛТАЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ Е.Г. Парамонов, А.А. Маленко ОСНОВЫ ЛЕСОВОДСТВА И ЛЕСОПАРКОВОГО ХОЗЯЙСТВА Учебное пособие Барнаул Издательство АГАУ 2007 УДК 634.0.2.(635.91) Парамонов Е.Г. Основы лесоводства и лесопаркового хо зяйства: учебное пособие / Е.Г. Парамонов, А.А. Маленко. Бар наул: Изд-во АГАУ, 2007. 170 с. Учебное издание ...»

«МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ АЛТАЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ Е.Г. Парамонов, А.П. Симоненко ОСНОВЫ АГРОЛЕСОМЕЛИОРАЦИИ Учебное пособие Барнаул Издательство АГАУ 2007 УДК 634.0.2.(635.91) Основы агролесомелиорации: учебное пособие / Е.Г. Пара монов, А.П. Симоненко. Барнаул: Изд-во АГАУ, 2007. 224 с. В учебном издании приведены основные положения, рас крывающие ...»

«издательство ВАЛЕНТИН Владивосток Издательство Валентин 2012 УДК 94(571.6) ББК 63.3 П13 Пак В. П13 Земля вольной надежды. Книга 1. Очерки дореволюци- онной истории Надеждинского района / В. Пак. – Вла- дивосток: Валентин; 2011. – 216с. ISBN 978-5-9901711-5-2 Земля Вольной Надежды раскрывает страницы истории На- деждинского района. Повествование охватывает в основном период с середины ХIХ века по 1917 год, когда шло заселение далёкой окраи ны, развивающей российскую государственность с момента ...»

«5 Turczaninowia 2002, 5(3) : 5–114 СИСТЕМАТИЧЕСКИЕ ОБЗРОРЫ УДК 582.683.2(47) В.И. Дорофеев V. Dorofeyev КРЕСТОЦВЕТНЫЕ (CRUCIFERAE JUSS.) ЕВРОПЕЙСКОЙ РОССИИ CRUCIFERAE OF EUROPEAN RUSSIA Предлагаемый Вашему вниманию список сем. Cruciferae Европейской России является второй большой попыткой познакомить читателей Turczaninowia с представителями европейских крестоцветных. Первая работа, опубликованная в 3 выпуске за 1998 год, касалась крестоцветных Средней полосы европейской части Российской ...»

«ЧТЕНИЯ ПАМЯТИ АЛЕКСЕЯ ИВАНОВИЧА КУРЕНЦОВА A. I. Kurentsov's Annual Memorial Meetings _ 2011 вып. XXII УДК 595.7.001 А.И. КУРЕЦОВ: ДНЕВНИК ОБ ЭКСПЕДИЦИИ В УССУРИЙСКИЙ КРАЙ В 1928 ГОДУ Ю.А Чистяков Биолого-почвенный институт ДВО РАН, г. Владивосток Приведены дневниковые записи А.И. Куренцова за время его шестимесячной экспедиции в Уссурийский край в 1928 г. Записи содержат данные о растениях и растительности, насекомых, птицах и других животных, встреченных А.И. Куренцовым во время экскурсий, ...»

«МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ АЛТАЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ Н.Д. ОВЧАРЕНКО, О.Г. ГРИБАНОВА БИОЛОГИЯ ЖИВОТНЫХ УЧЕБНОЕ ПОСОБИЕ Барнаул Издательство АГАУ 2012 УДК 574. (072) Рецензенты: д.б.н., профессор, зав. кафедрой экологии Алтайского государст венного университета Г.Г. Соколова; к.б.н., доцент кафедры генетики и разведения сельскохозяйствен ных ...»

«1 Основы идеологии белорусского государства Под общей редакцией профессора С.Н. Князева и профессора С.В. Решетникова МИНСК 2004 2 УДК ББК И Авторский коллектив: кандидат юридических наук, профессор Князев С.Н., доктор политических наук, профессор Решетников С.В., доктор юридических наук, профессор Василевич Г.А., доктор политических наук, профессор Земляков Л.Е., кандидат философских наук, доцент Денисюк Н.П., кандидат политических наук, доцент Антанович Н.А., доктор философских наук, ...»






 
© 2013 www.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.