WWW.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 

Pages:     | 1 |   ...   | 9 | 10 || 12 | 13 |   ...   | 17 |

«Национальная академия наук Украины Институт микробиологии и вирусологии им. Д. К. Заболотного Институт биоорганической и нефтехимии Межведомственный ...»

-- [ Страница 11 ] --

Индивидуальные мРНП компоненты могут служить как адаптеры, которые позволяют мРНК взаимодействовать с многочисленными внутриклеточными факторами, которые опосредствуют их субклеточ ную локализацию, трансляцию и разрушение, а также с разными системами передачи сигналов. Некоторые адаптеры способствуют взаимодействиям и соответственно исполняют роль активаторов разных процессов, тогда как другие нарушают взаимодействия и действуют в качестве репрессоров.

Большинство компонентов комплексов цитоплазматических мРНП сначала собираются в ядре на стадии транскрипции и процес синга пре-мРНК. К таким факторам относятся нуклеоцитоплазмати ческие мобильные гяРНП (hnRNP — heterogeneous nuclear RNP) и SR (serine/arginine rich) белки, а также EJC-комплекс [712, 812, 1112].

Как гяРНП, так и SR белки имеют РНК-связывающие домены [712]:

SR белки дополнительно имеют домен, обогащённый серин аргининовыми дипептидами, который может взаимодействовать с разнообразными белками или РНК и подвергаться динамическому фосфорилированию [812]. EJC — вид белков, присоединяющихся к мРНК в процессе пре-мРНК сплайсинга. Необходимо отметить, что локализация EJC внутри ORF (открытой рамки считывания) после довательностей мРНК может положительно влиять на трансляцию, тогда как присутствие EJC в 3’-нетрансляционных регионах (UTRs) способствует быстрому разрушению мРНК через антисмысловой мРНК распад (nonsense-mediated mRNA decay — NMD) [1112]. Обна ружено, что некоторые SR-белки могут объединять эти эффекты, хотя преимущественное действие каждого из них зависит от места лока лизации SR на мРНК [812].

В процессе транспорта мРНП из ядра в цитоплазму через ядер ный комплекс пор (nuclear pore complex — NPC) принимают участие такие ядерные белки, как адаптеры экспорта мРНК, которые служат для связывания мРНК с одним или несколькими рецепторными белками-компонентами NPC. Значительная роль в экспорте мРНК в цитоплазму принадлежит также ядерным поли(А)-связывающим белкам PABPN1 и PABPCs, которые являются посредниками во взаи модействии мРНК с рецепторными белками — компонентами NPC [946]. После транспортировки мРНП в цитоплазму эти белки отде ляются от мРНК посредством фосфорилирования или при участии семейства DExH/D-box белков, принадлежащим к РНК-связывающим нуклеотидным трифосфатазам, которые могут удалять вторичные структуры или белки от мРНК [1046].

Экспортирующиеся в цитоплазму мРНП функционально взаимо действуют через присутствующий в них ядерный 5’кеп-связывающий Биорегуляция роста и развития растений комплекс (СВС 20/80) с фактором инициации трансляции 4G (eIF4G), который является посредником для присоединения к мРНП малых рибосомных субъединиц и инициации 5’-3’ сканирования (трансля ции) от 5’ UTR до AUG-стартового кодона [872]. Как только стар товый кодон идентифицирован, большие рибосомные субъединицы присоединяются к мРНП и формируют 80S-комплекс, ответственный за биосинтез белка.

Другие большие изменения в составе мРНП происходят в течение первого пассажа 80S рибосомы вдоль мРНК — «пионерский раунд»

трансляции [918, 919]. При прохождении мРНК между двумя рибо сомными субъединицами отделяются некоторые ядерные мРНП белки, такие как EJCs, расположенные внутри ORF. Белки CBC 20/80 и PABPN1 также заменяются мажорным цитоплазматическим кеп-связывающим elF4E и PABPCs белками соответственно. Как толь ко перестройка в структуре мРНК завершена, сеть одновременных взаимодействий между 5’ кепом, elF4E, elF4G, PABPCs, и поли(А) концом проявляется в функциональном круговороте передачи сигна лов. Эти перестройки облегчают трансляционный контроль регуля торными элементами в 3’UTR, способствуют эффективности реинициации рибосом в период активной трансляции, а также защи щают оба конца транскриптов мРНК от деградации [915].

Однако не все экспортированные в цитоплазму мРНК сразу пополняют трансляционно активный пул. Часть мРНК может акку мулироваться в виде запасных мРНК, необходимых для последующих стадий развития. Одним из ключевых механизмов торможения транс ляционной активности мРНК является существенное сокращение их поли(А)-конца от начальной ядерной длины (200—250 аденозинов) до 20—40 оснований (последовательностей). Это сокращение опосре дуется белком CPEB, который узнаёт цитоплазматический элемент полиаденилирования (СРЕ) в 3’UTR. Белок CPEB также взаимодей ствует с Maskin-белком, являющимся конкурентом белку elF4G за связь с белком elF4E [946]. Таким образом, взаимодействие Maskin elF4E белков ингибирует трансляцию. Для обратного процесса нача ла трансляции белок СРЕВ переходит в фосфорилированную форму и стимулирует удлинение поли(А)-конца цитоплазматическими поли(А)-полимеразами. Удлинённый поли(А)-конец связывается с белком PABPCs, который образует комплекс с белком elF4G для инициации трансляции [1045].

СРЕВ-Maskin-elF4E взаимодействие является одним из примеров трансляционной регуляции с участием «4Е ингибиторных белков»

путём elF4Е-elF4G взаимодействия. Некоторые 4Е белки-ингибиторы подобны Maskin-белку локализуются только в cis-элементах 3’-UTR и таким образом функционируют только в мРНК, содержащих этот элемент. Другой класс «Е4-связывающих белков» (4E-BPs) имеет неограниченную локализацию и таким образом действует более глобально, взаимодействуя с любыми доступными elF4Е белками;

в результате происходит ингибирование процесса трансляции мРНК, для которого необходим высокий уровень elF4Е. Этот вариант транс ляционной регуляторной схемы является основополагающим для процесса контроля роста и развития клеток, а также является ключе вым в супрессии роста раковых клеток у эукариот [1045].

Период существования мРНК всех эукариотических организмов является ограниченным и зависит от изменений внутриклеточных и внешнеклеточных факторов. В ключевом механизме деградации мРНК принимают главное участие ферменты рибонуклеазы (РНКазы), деаде нилазы, отщепляющие от мРНК 3’ поли(А)-конец, тогда как 5’ кеп удаляется специфическими ферментами декепирования [946]. Все «тело» мРНК окончательно деградирует под действием 5’3’ и 3’5’ экзо- и эндонуклеаз.

РНКазы у высших растений являются продуктами суперсемейства генов этих ферментов, выполняющих классическую роль в процес синге и деградации мРНК молекул на всех фазах онтогенеза растений, а также участвующих в защите растений от патогенов и других небла гоприятных факторов окружающей среды. На активность РНКаз значительное влияние могут оказывать фитогормоны, изменяя экспрессию генов РНКаз [651, 652, 775]. В настоящее время механизм деградации мРНК по специфическим последовательностям, осущест вляемый посредством РНКаз, остаётся малоизученным. Деградация большинства мРНК может выполняться РНКазами, специфичность которых определяется другими эффекторными молекулами [775]. К этим эффекторам относятся РНК-связующие белки, факторы РНК-локализации или ингибиторы РНКаз. Узнавание специфических нестабильных последовательностей мРНК эффекторными молекулами способно превращать соответствующие транскрипты в более эффек тивные субстраты для большинства РНКаз. Другой аспект РНК мета болизма — полиаденилирование является приоритетным для специфи ческих факторов, которые могут обеспечивать неспецифические ферменты способностью распознавать и различать транскрипты, содержащие специфические последовательности, от транскриптов, у которых эти последовательности отсутствуют [1162].

Большинство цитоплазматических транскриптов могут быть защи щены от быстрой деградации 5’ кепом и поли(А)-концом. Удаление кепа нуклеотид пирофосфатазой [616], а поли(А)-хвоста — поли(А) нуклеазой [1063] или генерация внутреннего расщепления сайт Биорегуляция роста и развития растений специфической эндорибонуклеазой [775] может служить ограничи вающим фактором для разрушения мРНК неспецифическими РНКа зами. Например, в клетках растений и дрожжей активность РНКазы — поли(А) нуклеазы (PAN) зависит от присутствия в моле куле мРНК поли(А)-связующего белка (PAB) [1063].

Существует также механизм эндонуклеолитической деградации через расщепление по специфическим последовательностям мРНК с участием РНК-индуцированного молчащего комплекса (RISC) в ассо циации с эндогенными малыми интерферирующими РНК (siRNA) [946, 1095, 1181]. Образуя комплексы с членами семейства Argonaute белков, miRNA и siRNA проявляют активность ферментов, расще пляющих молекулы-мишени мРНК по фосфодиэфирным связям на два фрагмента, причём для этого процесса необходим аденозинтри фосфат (АТФ) [785]. Затем расщеплённый 3’ фрагмент разрушается в цитоплазме экзонуклеазой Xrn1, тогда как 5’ фрагмент деградирует в экзосоме, представляющей комплекс ферментов экзонуклеаз, расще пляющих мРНК по 3’ и 5’ концам [984]. У растений и животных в процессе расщепления мРНК с участием miRNA происходит после довательное добавление короткого полиуридинового [поли(U)] хвоста к 3’ и 5’ расщепленным фрагментам [1085]. Добавление поли(U) коррелирует с декепированием и 5’3’ разрушением фрагментов расщепления РНК, что свидетельствует об альтернативном участии экзосомы в деградации 5’ продуктов расщепления.

Общий механизм мРНК деградации также включает элиминацию аберрантных мРНК, которые имеют преждевременный трансляцион ный стоп-сигнал (антисмысловые мРНК) или у которых отсутствует трансляционный стоп-сигнал в целом (антистоп-мРНК) [918, 919, 946]. Такие дефектные мРНК могут появляться вследствие генетиче ских мутаций, неправильного сплайсинга, а также преждевременного полиаденилирования. Эффективная элиминация этих мРНК защища ет клетки от потенциально вредных последствий не полностью синте зированных белков. Для узнавания антисмысловых и антистоп-мРНК необходимо их функциональное сцепление с рибосомами, которые не имеют возможности завершать процесс трансляции соответствую щим образом на антисмысловых и антистоп-мРНК [583, 918, 919, 946]. Такая некорректная терминация приводит к восстановлению процесса разрушения преимущественно через взаимодействие с рибо сомными высвобождающимися факторами или через незанятый А сайт тРНК-связывающего «кармана» на рибосоме. Установлено также, что в элиминации аберрантных мРНК принимают участие члены суперсемейства ферментов полимераз -нуклеотидилтрансфераз, которые добавляют поли(А)-хвост (являющийся сигналом деградации) к аберрантным мРНК, превращая их таким образом в мишень для разрушения в ядерной экзосоме — комплексе ферментов деградации РНК [828, 866, 1142].

Если в клетках растений процессы деградации каждой из молекул мРНК контролируются генами, которые кодируют специфические РНКазы к каждой структуре мРНК (мРНП), то полученные нами факты повышения стойкости растений (с помощью регуляторов роста) к вирусным патогенам можно объяснить активацией регуляторами роста экспрессии генов синтеза специфических РНКаз — катализа торов деградации (разрушения) вирусных мРНК и других мРНК (мРНП) патогенов. Действительно, когда в среду, на которой выра щивали растения, добавляли ингибиторы РНКаз (ванадил рибонуклеозидные комплексы) [95], резко снижалась стойкость расте ний к патогенам.

Данные последних лет является свидетельством того, что боль шинство мРНП функционируют в специфических субклеточных структурах или в группах с другими мРНП;

соответственно и процесс деградации мРНП эукариот происходит в специфических местах — в дискретном цитоплазматическом пространстве. Цитоплазматические процессинг-тела (P-bodies — PBs) формируют агрегаты вокруг мРНП, которые не принимают активного участия в трансляции [1116]. Объе диненные с этими структурами мРНП удаляются из трансляционно активного пула. Одним из механизмов этого процесса является взаи модействие miRNA с RISC комплексом [888]. Предполагается, что первоначально miRNA репрессируют трансляцию на этапе присоеди нения рибосом к мРНК, т. е. на стадии инициации трансляции [983].

Альтернативно они могут «замораживать» рибосомы на мРНК, оста навливая элонгацию растущей белковой цепи. Репрессия трансляции посредством miRNA включает не только ингибирование биосинтеза белка, но и определяет стабильность мРНК [1181]. Малые РНК совместно с Argonaute белками связываются с мРНК и далее пере двигаются из цитозоля в сайты разрушения мРНК, называемые «P-bodies» [888, 1079]. Попадая в P-тельца, мРНК деградируют, высво бождая miRNA-белковый комплекс, который снова возвращается в цитозоль и начинает новый раунд репрессии мРНК.

Другими структурами, инактивирующими трансляционную актив ность мРНП, являются стрессовые «гранулы» (SGs) — цитоплазма тические структуры, в состав которых входят трансляционно неак тивные мРНП, 40S рибосомные субъединицы и мРНК-связывающие белки TIA-1 и TIAR. Прион-подобные омены в TIA-1/TIAR могут само-олигомеризоваться и способствовать SGs-сборке [765, 946]. Хотя Биорегуляция роста и развития растений трансляционный «арест» многих мРНК в условиях стресса является защитной и адаптационной реакцией организмов, в этот период происходит селективная трансляция белков «температурного шока», а также некоторых транскрипционных факторов, что позволяет клет ке возобновлять стресс-индуцированные повреждения, сохраняя анаболическую энергию. После окончания стресса SGs распадаются и изолированные мРНК пополняют трансляционно активный пул или направляются для деградации в PBs [584].

Достижения последних лет существенно пополнили представле ние о том, каким образом эукариотические клетки регулируют экспрессию генов на уровне мРНП.

Мы предположили, что в бесклеточной системе, как и in vivo, могут образовываться (путём самоорганизации или самосборки) функ ционально активные мРНП за счёт синтеза in vitro соответствующих белков. Для проверки этого нами были изолированы из инкубаци онной среды препараты РНП-частиц (смесь рибосомных и матричных РНП), которые затем фракционировали в градиенте плотности CsCl.

На рис. 93 слева представлено распределение препаратов РНП-частиц необработанных, а справа — обработанных малыми дозами бычьей РНКазы (2 мкг/мл), при которых как видно рибосомные РНП не разрушаются, а матричные РНП разрушаются полностью.

Этот результат указывает на возможность формирования в бескле точных системах белкового синтеза (по аналогии с процессами in vivo) как рибосомных, так и матричных функционально активных РНП.

рис. 93. Распределение в градиенте плотности CsCl РНП-частиц из бесклеточной системы белкового синтеза пшеницы:

1 — оптическая плотность рРНП;

2 — радиоактивность мРНП;

3 — градиент плотности CsCl;

а — РНП-частицы без обработки;

б — РНП-частицы после обработки РНКазой Приведённые аргументы убедительно показывают, что бесклеточ ные системы белкового синтеза можно использовать для изучения регуляции генетических процессов (экспрессии генов) на уровне транс ляции генетической информации. Этот методический приём вероятно может быть использован для: 1) отбора эффективных регуляторов роста;

2) синтеза (наработки) белков, применяемых в медицине.

Семейства генов — в адаптации растений к окружающей среде и влияние регулятора роста эмистима С К настоящему времени известно, что большинство генов в клетках растений (как и в клетках животных) представлены семействами. Напри мер, мультисемейство генов фотоморфогенеза [590, 856, 1107];

семейство генов фосфолипазы С состоит из 9 членов [659, 1113, 1042];

фосфолипа зы D — из 12 членов [878];

генов пататина — из 70 членов на тетрапло идный геном Solanum tuberosum L. [160, 889, 890, 938, 1047, 1055];

генов белка клеточной стенки экстенсина — из 5 членов [576, 668, 728], гены РНКаз представлены супер- или мультисемейством [775] и т.д.

Каждый из представителей семейства генов отличается друг от друга микрогетерогенностью по нуклеотидной последовательности в вариабельной части генов и соответственно по механизмам их внутри клеточной регуляции [659, 878, 1113, 1042]. Отображением структур ной микрогетерогенности в семействах генов являются и мини разли чия в структурах продуктов генов — белков (полиморфизм запасных белков, изоферментов и др.) [85, 442].

Очевидно, что вариабельность в структурах членов семейства генов, различия в механизме регуляции их активности и, соответ ственно, мини различия в структурах конечных продуктов экспрессии генов обеспечивают высокую манёвренность (мобильность) и пластич ность адаптивных реакций клеток к сигналам окружающей среды.

Известно, что областью (сайтом) инициации транскрипции явля ется регуляторная последовательность генов — промотор, на котором происходит формирование инициирующего транскрипционного комплекса (транскриптосомы по аналогии с рибосомой), включаю щего регуляторные элементы промотра, РНК-полимеразу II и множе ство транс-факторов белковой природы (около 70) [1018], одни из которых служат для восприятия и реализации внешних сигналов в процессах инициации транскрипции, другие — для коррекции этих процессов со стороны иных регуляторных областей генов — сайлен серных и энхансерных последовательностей ДНК, обеспечивающих необходимую скорость и уровень транскрипции (копирование пред шественника мРНК с ДНК матрицы — кодирующей части генов).

Биорегуляция роста и развития растений Важно отметить, что одним из основополагающих элементов инициирующего транскрипционного комплекса является структура (нуклеотидная последовательность) областей регуляции прежде всего самого промотора, которая и определяет уровень и продолжитель ность циклов транскрипции генов. Все промоторы структурных генов (в том числе и органоспецифические) по своей активности делят на сильные промоторы, умеренной силы и слабые промоторы. Сильные промоторы — это в большинстве конститутивные (работающие как и промоторы вирусных и бактериальных генов, непрерывно, напри мер, ген металлотионеина) [756, 763, 781].

К настоящему времени в мире клонировано и секвенировано около 50 промоторов генов растений [1018]. В нашей лаборатории клонировано два органоспецифических промотора — один корнеспе цифический промотор умеренной силы, а другой — сильный промо тор пататинового гена класса I вместе с энхансером [102, 160].

Мы предположили, что под слабыми промоторами стоят вари анты генов из семейств, формирующих ответ на слабые внешние сигналы (например, на слабый тепловой, световой, или химический сигналы). Под промоторами умеренной силы расположены гены, формирующие ответ на сигналы средней силы, а под сильными промоторами стоят гены из семейств генов, формирующие ответные реакции клеток на сильные внешние или внутренние сигналы (напри мер, на максимальный фотосинтез в период сильного солнечного освещения и, соответственно, сильного нагрева).

В соответствии с этим предположением, усиление процесса фото синтеза возникает в результате «веерного» переключения соответ ствующих генов под слабыми промоторами на гены с промоторами умеренной силы и далее на гены под сильными промоторами в процессе увеличения солнечной активности и наоборот, при сниже нии солнечной активности наблюдается противоположный процесс переключения генов.

Для проверки правомерности этих предположений мы провели опыты по определению степени гомологии между популяциями цито плазматических мРНК клеток растений при различной интенсивности солнечного освещения на протяжении суток.

В качестве объектов исследований использовали листья двудоль ных (соя, горох) и однодольных (пшеница, кукуруза) растений на десятидневный период их вегетации после начала прорастания семян, растущих в естественных (полевых) стандартных условиях, и, в первую очередь, при слабом и сильном ясном солнечном освещении. Экспе рименты проводили в начале июня, когда происходит интенсивный рост и развитие растений. Препараты цитоплазматических мРНК выделяли из листьев растений в различные периоды светового дня:

утром (в 5.00) — в период появления первых лучей солнца;

в сере дине дня (14.00) — в период максимального солнечного освещения и в вечерний период (21.00). В качестве контроля служили препара ты цитоплазматических мРНК из листьев в период отсутствия осве щения в середине ночного времени (в 2.00).

Опыты повторяли каждый день подряд на протяжении трёх дней, для того, чтобы не накладывались показатели расхождения гомологии мРНК за счёт стадийных изменений популяций мРНК. Определяли также степень гомологии мРНК из листьев на более отдаленной стадии развития растений (через последующие 10 дней) относитель но контрольных мРНК для установления стадийных различий.

Одновременно с этими опытами изучали также влияние регуля тора роста эмистима С на популяционные характеристики цитоплаз матических мРНК в указанные выше периоды суток с целью провер ки предположения, происходит ли преждевременное включение генов под сильными промоторами в период слабого освещения вместо включения генов под слабыми промоторами или одновременно и тех и других.

Основой для этого послужили опыты с кофейными растениями, которые росли в лабораторных помещениях с комнатным освещени ем и продуцировали кофейные зерна. Поливка этих растений раство ром эмистима С приводила к резкому повышению продуктивности растений (вместо одного урожая зерен собирали три в течение года), с формированием у них темно-зеленых листьев при слабом комнат ном освещении, что обычно наблюдается при сильном освещении. В опытах in vitro было также показано, что культивирование каллусов табака в темноте на среде, содержащей либо ивин-ян, либо эмистим С, вызывает их позеленение и замедляло процесс старения (прибли зительно в 2 раза) [1134].

Данные проведенных экспериментов приведены в табл. 74, из которой следует, что как у двудольных, так и однодольных растений, с появлением солнечных лучей ранним утром (5.00) происходит небольшое снижение степени гомологии мРНК в опыте по сравнению с контролем (до 91 % для разных растений).

В середине дня (к 14.00) по сравнению с пятью часами утра происходит большее расхождение между контрольными («ночными») популяциями мРНК и мРНК из листьев растений при мощном освещении. К вечеру происходит снижение фотосинтетических процессов видимо путем «веерного» переключения генов, располо женных под сильными промоторами на гены под слабыми промо торами (см. табл. 74).

Таблица 74. Гомология популяций цитоплазматической мрнк из листьев растений в разные периоды световой (утренней, дневной и вечерней) фазы (опыт) по отношению к мрнк темновой (середина Время 5.00 95,0±2,2 84,0±1,9 86,0±1,7 97,0±2,1 84,0±1,6 89,0±1,4 91,0±1,6 82,0±2,2 88,0±1,3 94,0±1,5 86,0±2,1 85,0±2, 14.00 86,0±2,3 78,0±1,8 81,0±1,8 85,0±1,4 79,0±1,9 84,0±1,3 79,0±2,3 75,0±1,8 86,0±1,6 79,0±2,1 76,0±1,8 78,0±1, 21.00 89,0±1,4 84,0±1,6 78,0±1,3 94,0±1,8 83,0±1,6 86,0±2,1 93,0±1,4 86,0±1,3 88,0±1,8 92,0±1,9 84,0±1,7 87,0±1, *Процент гомологии цитоплазматических мРНК по отношению к контрольному препарату мРНК (принятому за 100 %) определяли по показателю разницы в уровне гибридизации Р 32 кДНК с популяциями мРНК, которые изменяются в течение суток и отличаются нуклеотидной последовательностью в пределах семейства. За 100 % (контроль) принят уровень гибридизации Р32 кДНК (копий с «ночной»

мРНК) с «ночной» мРНК листьев растений (гибридизация «сама на себя»). Ошибка опыта ± 2 % (приведены средние данные из трёх опытов). Единица измерений — уровень радиоактивности в импульсах в каждой пробе.

ний [84].

ции [755].

толщины эпидермиса листьев, солнечном излучении. В пользу шее снижение фотосинтетиче ном увеличении практически интенсивности процессов фото усилении структуры проводя ченные результаты о значитель риментов. Это можно объяс мРНК популяциях между филла (табл. 75), увеличении цировки клеток растений на эмистимом С значительно Предобработка растений шение регулятором роста контрольными растениями и наблюдается значительно мень ма С в листьях растений хлоро ца в популяциях мРНК из Таким образом, у обрабо синтеза даже при слабом пательные процессы дифферен усиливает разницу в степени растениями на более поздних щих сосудистых пучков расте на 36 % под влиянием эмисти утра. Это указывает на повы гомологии мРНК контрольных генов, обеспечивающих посту нить, возможно, включением в вегетации после начала экспе Наблюдается также разни ской активности, и различия в танных эмистимом С растений размера листовой пластинки и и опытных растений уже в 5 ч последующих этапах их вегета экспрессию частично и других и растений на двадцатый день листьев контрольных растений этого свидетельствуют и полу стадиях онтогенеза вызваны включением в работу уже частично других генов, обеспечивающих последовательные процессы дифференциации клеток растений.

Однако резких различий в популяциях мРНК из дневных расте ний и растений, обработанных эмистимом С, а также спустя десять дней после дальнейшей вегетации (т. е. через двадцать дней после начала эксперимента) не наблюдается. Это свидетельствует о том, что экспрессия генов под сильными промоторами находится на макси муме в середине дня, а экспрессируются однотипные или неодно типные гены в клетках листьев полудневных растений и у растений более продолжительного срока вегетации пока что сказать нельзя на основании полученных данных.

Данные литературы, посвящённые исследованию молекулярных механизмов регуляции экспрессии генов светом [590], свидетельству ют в пользу того, что фотосинтезирующие организмы используют комплексные биохимические системы, воспринимающие и отвечающие на различные световые волны. У высших растений идентифицированы различные классы фоторецепторов: фитохромы, абсорбирующие крас ный/дальний красный свет и хлорофилл, воспринимающий красный свет;

криптохромы, фототропины и каротиноиды, селективно абсор бирующих синий/УФ-А/УФ-В свет. Световые сигналы абсорбируются этими рецепторами и передаются ассоциированными молекулярными системами, регулирующими экспрессию генов как на транскрипцион ном, так и посттранскрипционном уровнях.

В регуляции транскрипции свето-индуцируемых генов растений принимают участие многочисленные cis-регуляторные элементы промоторов и trans-активирующие факторы. В настоящее время около 30 различных классов структурно и эволюционно консервативных последовательностей ДНК-модулей (CMAs), ассоциированных со свето-респонсивными элементами (LREs) регионов промоторов иден Таблица 75. влияние регулятора роста эмистима с на структурно морфологические и продуктивные показатели озимой пшеницы (2009 г.) Общая площадь листовой пластинки Общая площадь листовой пластинки Содержание хлорофилла в сырой Биорегуляция роста и развития растений тифицировано с помощью нового филогенетического структурного анализа и проанализировано более чем 110 свето-регулируемых генов растений [590]. Эти СМАs имеют общую суперсемействогенную спец ифическую основную последовательность, коррелирующую с фитохром-зависимым путём передачи, контролирующим их экспрес сию, т. е. ACCTA(A/C)C(A/C) последовательность для cGMP зависимых генов, регулирующих метаболизм фенилпропаноидов (суперсемья PhMAGs генов, кодирующих ферменты биосинтеза анто цианов, т. е. chs), and GATA(A/T)GR — для Ca 2+/кальмодулин зависимых ядерных генов, регулирующих фотосинтез (суперсемья PhANGs генов, кодирующих белки хлоропластов, т. е. rbcS).

В соответствии с гипотетической моделью структурной функ циональной организации PhANGs и PheMAGs LREs [590], свет абсор бируется фоторецепторами фитохромами, затем последовательно компоненты ассоциированной системы передачи сигналов воздей ствуют со специфическими транскрипционными факторами, которые становятся активными или неактивными в соответствии с их регуля торной функцией. В соответствии с положительным сценарием регу ляции, транскрипционные факторы: IB/LAMP-связывающие факторы (IBFs), которые взаимодействуют с IB/LAMP-родственными модуля ми (свето-специфическими элементами — LREs генов PhANG), и H-box связывающие факторы (HBFs), которые взаимодействуют с H-box-родственными мотивами, активируются светом и могут присо единять самостоятельно или ассоциировано с другими транскрипци онными факторами (формируя гетеротримерный регуляторный комплекс) к соответствующим им ДНК-узнающим сайтам (LiS элемен там). Если надлежащие экзогенные и/или эндогенные сигналы пере секаются со световыми сигналами, фотореспонсивные элементы могут активировать транскрипцию генов. В соответствии с негативным сценарием регуляции, IBFs и ядерные-связывающие факторы функ ционально взаимодействуют и активируют транскрипцию независимо от воздействия света. В отсутствие света, регуляторы подобные тако вым у деэтиолированных/конститутивных фотоморфогенетических растений, взаимодействуют с IBFs, формируя мультикомпонентный репрессорный комплекс.

Данные наших исследований позволяют предположить, что эмистим С включает те гены фотоморфогенеза, которые экспресси руются в его активной фазе (в середине дня) и при нормальных условиях включаются в работу специфическим спектром солнечного освещения, преобладающим в этот период суток.

Таким образом, наличие семейств генов и специфических меха низмов регуляции каждого из них обеспечивают, очевидно «веерное»

переключение генов (под влиянием тех или иных сигналов), выпол няющих одни и те же функции, но характеризующихся микрогете рогенностью по нуклеотидным последовательностям и разным уров нем активности. Это и обеспечивает адаптацию растений к изменяющимся условиям и воспроизведение себе подобных особей в большем или меньшем количестве при разных условиях для поддер жания и сохранения в природе той или иной видовой популяции растений.

Эффект действия регулятора роста эмистима С достигается (см.

табл. 74) путём преждевременного (не предусмотренного природой в этот период) включения им генов с высокой активностью под силь ными промоторами в неадекватных для их функции условиях, что и проводит к ускорению роста и развития растений, в результате чего усиливается их продуктивность даже в неблагоприятных условиях, соизмеримых с показателями, которые можно получить без примене ния регуляторов роста в самых оптимальных условиях освещения.

индукция устойчивости растений к фитопатогенам с помощью регуляторов роста природного происхождения Стимуляция фитоиммунных реакций растений как способ мобилизации системной устойчивости к фитопатогенам Внедрение и широкое использование биотехнологий в агропро мышленном секторе является приоритетом государственной полити ки многих стран и служит залогом повышения эффективности сельс кохозяйственного производства. Это способствует пониманию необходимости перехода к экологическому сельскому хозяйству, в основе которого лежит широкое применении биопестицидов.

В настоящее время самый экологически чистый метод защиты растений — традиционная селекция болезнеустойчивых сортов. Одна ко патогенные микроорганизмы вырабатывают гены вирулентности быстрее, чем создаются устойчивые сорта [70]. В то же время иссле дователи все чаще приходят к пониманию, что генетический потен циал устойчивости растений достаточно высокий, но не полностью реализуется в стрессовых условиях, в том числе при действии агрес сивных штаммов фитопатогенов. Новейшие исследования в области фитоиммунитета открыли новые возможности повышения устойчи вости растений за счёт стимулирования иммунной системы с помо щью биологически активных веществ — индуцированной устойчиво сти растений.

Учитывая, что все растения обладают генами устойчивости и способны определённым образом реагировать на заражение, С. Л. Тюте Биорегуляция роста и развития растений рев [516] сформулировал гипотезу о возможности стимулирования фито иммунных реакций определёнными веществами-стимуляторами, а также разработки препаратов, активирующих эти реакции при заражении растений фитопатогенами. При этом основное внимание направлено не на фитопатогены, а на растения, которые мобилизуют свой генетиче ский потенциал и справляются с инфекцией с помощью собственных метаболитов. Это позволяет растениям мобилизовать системную устой чивость на весь период вегетации за счёт экспрессии генов устойчивос ти растения.

Иммунный ответ растения на контакт с фитопатогеном начина ется с реакций узнавания патогена с помощью сигнальных молекул элиситоров [119]. При этом появляются первые ответные реакции растения на действие патогена — изменение в клетке концентрации кальция, который способствует фосфорилированию белков, измене ние рН среды в межклеточном пространстве и внутри клетки. Одним из важных звеньев в развитии иммунного ответа растения является активация пероксидазы и НАДФН-оксидазы. Первый фермент участвует в лигнификации клеточных стенок для механической изоля ции патогена и образования активных форм кислорода.

НАДФН-оксидаза также запускает реакции образования актив ных форм кислорода, а основной продукт этого фермента — пере кись водорода — активирует пероксидазу. Образование активных форм кислорода (окислительный взрыв), с одной стороны, являет ся методом прямого действия растения на патоген, с другой сторо ны, принимает участие в лигнификации клеточных стенок. Окис лительный взрыв является одним из активаторов второй фазы защитных реакций — транскрипции генов устойчивости [252]. След ствием является индукция фенилаланинаммиаклиазы, повышение содержания салициловой кислоты, изменение состава фенолов, усиление антиоксидантной защиты, процесса лигнификации, синте за фитоалексинов и т. д.

Таким образом, применение механизмов, которые использует устойчивое растение против поражения фитопатогеном, является основой индуцированной устойчивости или «иммунизации» [126].

Известно, что иммунизация является основным инструментом профи лактической медицины, о существовании иммунной системы у расте ний известно ещё с начала ХХ ст., но практическая возможность влияния на неё появилась лишь в последние десятилетия.

Большинство литературных данных касается иммунизации расте ний, связанной с «перекрестной защитой», которая достигается в результате обработки растений непатогенными расами, ослабленными культурами паразитов [303] или элиситорами, выделенными из пато генных или непатогенных грибов [127, 137, 467]. В настоящее время ассортимент элиситоров достаточно широкий. Это направление имеет большой исторический опыт. За последнее десятилетие оно получи ло развитие во многих странах на солидном научном фундаменте, что дало возможность осуществить переход от грибных или бактери альных культур к препаратам очищенных элиситоров.

Параллельно повышенное внимание уделяется исследованию взаимодействия в системе растение—патоген и биологически актив ных веществ, являющихся составными большинства регуляторов роста растений, которые широко используются в сельскохозяйственном производстве.

Во многих лабораториях мира производится поиск экологически безопасных способов защиты растений, которые основаны на их естественной устойчивости против болезней. В настоящее время ассортимент препаратов, повышающих естественную устойчивость растений к фитопатогенам, достаточно большой. Это, например, агат 25К (создан на основе микроорганизма Pseudomonas auerofaciens и продуктов его метаболизма), эль-1 (содержит арахидоновую кислоту, выделяемую из морских водорослей), иммуноцитофит (действующее начало — этиловый эфир арахидоновой кислоты) и др. На рынке средств химической защиты растений появились препараты нового поколения — индукторы устойчивости на основе хитозана [486].

Хотя эти препараты по эффективности уступают биоцидным средствам защиты, они имеют большие перспективы для дальнейше го усовершенствования и, прежде всего, при создании комплексных препаратов регуляторов роста полифункционального действия.

Одним из таких препаратов является регулятор роста Kerry Enhancer 50 (KE-50), созданный на основе морской бурой водоросли Ascophillum nodosum ирландской компанией Kerry Algae Ltd. [977].

Регуляторы роста типа КЕ-50, созданные на основе морских водорослей, заслуживает пристального внимания [935, 977]. Это объясняется тем, что запасы природного сырья для их получения практически не ограничены [861]. В их составе присутствуют веще ства, непосредственно ингибирующие рост патогенов. Морские водо росли и экстракты, полученные из них, кроме фенолов содержат значительное количество веществ, обладающих антимикробным действием, на что в последнее время обращают внимание также работники фармацевтической промышленности [1129].

Близким по составу является концентрат продуктов термофиль ного метанового брожения (ПТМБ), полученный на Андрушовском спиртзаводе (Житомирская обл.) путём термофильного метанового сбраживания последрожжевой мелясной барды [567]. Оба препарата Биорегуляция роста и развития растений содержат не только фитогормоны, аминокислоты, витамины, но и фенольные вещества и антибиотики, что свидетельствует о сложной природе их влияния на растения.

Различный состав веществ, которые включают эти препараты, обусловливает вариабельность их действия не только как регуляторов роста, но и индукторов устойчивости. И ПТМБ, и КЕ-50 содержат фитогормоны, но их содержание в КЕ-50 в 5 раз больше, чем в ПТМБ. В состав КЕ-50 входят полифенолы, антибиотики, алкалоиды и индолы, в том числе и токсические. Последние соединения обна ружены и в составе ПТМБ, но действие этого препарата прежде всего обусловлено высоким содержанием витаминов группы В (до 200 мг/кг) [567]. Роль витаминов в индукции устойчивости сложная, поскольку они влияют на метаболизм не только растения, но и патогена и, возможно, положительно [460].

В нашей работе мы использовали оба препарата (КЕ-50 и ПТМБ).

Учитывая различную природу отобранных нами регуляторов роста, целью нашего исследования было изучение их влияние на реакцию иммунного ответа, а также их непосредственное биоцидное действие на возбудителей болезни, что может увеличить биологическую эффек тивность препаратов.

Наиболее достоверно оценить индуцированную устойчивость можно лишь с учётом визуальных проявлений, которые, к сожалению, не всегда выражены. В различных системах патоген—растение в определённых условиях ведущую роль играют защитные реакции.

Определение наиболее существенных среди них в формировании устойчивости довольно проблематично. Но для решения практических задач необходимо иметь определённое количество объективных пока зателей, характеризующих устойчивость растительных тканей. По данным А. П. Дмитриева [137], это могут быть фитоалексины. Другие авторы [152] предлагают в качестве маркеров устойчивости исполь зовать изоформы пероксидаз, оксидоредуктаз и др.

Одним из показателей увеличения устойчивости может быть влияние регуляторов роста на ростовые процессы растений, обеспе чивающих ускорение прохождения фаз развития, чувствительных к действию фитопатогена.

Стимуляция ростовых процессов под влиянием регуляторов роста как фактор повышения устойчивости Основной недостаток современных индукторов устойчивости — их недостаточная биологическая эффективность. При их использова нии не всегда отмечается снижение развития заболеваний, особенно на жёстких инфекционных фонах. Мы изучали влияние природных регуляторов роста на заражение растений пшеницы корневой гнилью на ранних этапах её онтогенеза.

На искусственном инфекционном фоне под влиянием регулято ров роста ПТМБ и КЕ-50 снижение степени зражения наблюдалось лишь при заражении проростков пшеницы Gaeumannomyces graminis var. tritici (на 26,9 и 19,2% соответственно) и Oculimacula (О.) yallundae (соответственно на 18,9 и 35 %), причём это снижение было стати стически достоверным только у варианта с O. yallundae при обработ ке КЕ-50 (рис. 94).

Отмечено также некоторое снижение развития фузариоза при обработке КЕ-50 (на 14,7 %). Практически не влияли регуляторы рис. 94. Изменение ростовых параметров проростков озимой пшеницы под влиянием регуляторов роста природного происхождения на фоне заражения патогенами:

1 — здоровые (незаражённые) проростки;

2 — заражение Fusarium graminearum;

3 — заражение Cochliobolus sativus, 4 — заражение Gaeumannomyces graminis var.

tritici;

( ) — контроль, ( ) — продукт термофильного метанового брожения, ( ) — КЕ- Биорегуляция роста и развития растений роста на развитие болезни на фоне заражения проростков Cochliobolus (С.) sativus. Таким образом, невысокое снижение развития болезни под влиянием регуляторов роста возможно, но стабильный эффект достигался с трудом. Следовательно, биологическая эффективность регуляторов роста зависит как от вида возбудителя (болезни), так и от состава препарата. Различие между видами можно объяснить также длительностью процессов заражения: возбудители офиоболе за и церкоспорелеза заражают растения медленнее (до 1 мес), чем Fusarium (F.) graminearum и C. sativus (1—2 нед). Следовательно, за 1—2 нед растения не успевают в достаточной степени мобилизовать свой иммунный потенциал и защититься от заражения F. graminearum и C. sativus.

Большую эффективность КЕ-50 по сравнению с ПТМБ можно объяснить тем, что последний содержит значительно меньше феноль ных соединений, которые ингибируют возбудителей болезни. Таким образом, при использовании регуляторов роста природного проис хождения в качестве индукторов устойчивости на искусственно созданных жестких инфекционных фонах мы практически не отме чали снижения развития корневой гнилью. Об этом сообщают и другие исследователи [136].

В связи с более низкой биологической эффективностью препа ратов природного происхождения по сравнению с фунгицидами использование индуцированной устойчивости требует дополнительных научно-исследовательских работ. Изучение её возможностей для целе направленного использования является чрезвычайно актуальным.

Кроме того, с помощью регуляторов роста можно косвенно влиять на устойчивость, регулируя скорость прохождения растением ранних этапов онтогенеза, наиболее чувствительных к заражению возбудите лями болезней, в частности, корневой гнилью.

Заражение растений болезнями приводит к снижению их продук тивности. На начальных этапах онтогенеза это проявляется в сниже нии таких ростовых параметров, как масса проростка, масса корней, длина проростка и т. д. В наших исследованиях при заражении F. graminearum отмечено уменьшение массы одного проростка озимой пшеницы на 21,5 %, при заражении C. sativus — на 16,1 % и G. graminis var. tritici — на 23,5 %, а массы корней — соответственно нa 37,5;

12,5 и 25 % (cм. рис. 94).

Обработка проростков регуляторами роста ПТМБ и КЕ-50 на фоне заражения патогенами способствовала увеличению массы проростков по сравнению с необработанным контролем, причём ПТМБ в большей степени увеличивал зеленую массу, а КЕ-50 — корневую систему (см. рис. 94). В результате масса растений, обра ботанных ПТМБ, превышала массу необработанных на 11,1—64,9 %, КЕ-50 — на 3,2—24,6 %. Следовательно, с помощью регуляторов роста можно нивелировать негативное влияние патогенов на рост растений на ранних этапах онтогенеза.

Чтобы объяснить это явление необходимо понять, каким обра зом патогены влияют на рост и развитие растений. Известно, что при заражении параллельно протекает два противоположных процес са — заражение (патогенез) и формирование устойчивости. Устой чивость растений тесно связана с ростовыми процессами и уровнем фитогормонов в тканях.

Рост растений базируется на образовании клеточных, тканевых и органных структур. Безусловно, весь процесс новообразованных структурных элементов находится под ядерным контролем, что и обусловливает их размер, форму и время новообразования. Градиент и баланс фитогормонов регулирует интенсивность этого процесса, ускоряя или замедляя его.

Содержание фитогормонов и активность изоформ пероксидазы в проростках сортов озимой пшеницы, различных Фитогормональная система играет ключевую роль в реализации индуцированной устойчивости растений к неблагоприятным факто рам среды. Это касается также влияния фитопатогенных микро организмов и грибов [1012]. Существенную роль в индукции устой чивости играют изменения в составе фитогормонов при заражении злаковых растений патогенными грибами. Данные литературы [324, 325] свидетельствуют об изменении баланса фитогормонов в систе ме пшеница — некротроф Septoria tritici. Различные сорта пшеницы неодинаково реагировали на заражение: синтез абсецизовой кисло ты и цитокининов активировался у устойчивых, а индолилуксусной кислоты — у неустойчивых к поражению сортов.

Неизвестно, направлены эти изменения на усиление патогенеза или индукцию устойчивости, поскольку большинство патогенных грибов синтезируют фитогормоны в достаточно больших концентра циях [241, 531, 532]. Поэтому нами изучены изменения в содержании фитогормонов в проростках сортов пшеницы, различных по устой чивости к некротрофу F. graminearum после заражения этим патоге ном. Одновременно исследовали активность изоформ пероксидазы, принимающей участие в окислении индолилуксусной кислоты и синтезе лигнина [13].

Биорегуляция роста и развития растений В опытах использовали 14-дневные проростки двух сортов озимой пшеницы, различных по устойчивости к данному патогену:

Колумбия (устойчивый) и Белоцерковская полукарликовая (воспри имчивый). Для определения содержания фитогормонов использо вали метод количественной спектроденситометрической тонкос лойной хроматографии [454]. Изоферментный состав пероксидазы определяли во фракции растворимого белка проростков озимой пшеницы. Электрофоретическое разделение катионных изофермен тов пероксидазы проводили в 10 % ПААГ при рН 4,3 с примене нием -аланинового буфера согласно методу Рейсфельда [1039], анионных изоферментов — в 10 % ПААГ рН 8,9 с трис-глициновым электродным буфером [462]. Визуализацию изоферментов перок сидазы в ПААГ после электрофореза осуществляли инкубацией гелей в ацетатном буфере с добавлением бензидина и перекиси водорода.

Определение количества белка проводили методом О. Н. Лоури.

Для определения пероксидазной активности измеряли оптическое поглощение при 620 нм продуктов реакции, которые образовались при окислении бензидина в присутствии Н2О2. Активность перокси дазы определяли по изменению оптического поглощения на 1 мг белка-фермента [67].

Нами обнаружено, что вследствие заражения F. graminearum содержание абсецизовой и индолилуксусной кислот в проростках устойчивого сорта Колумбия уменьшалось, а у чувствительного к патогену сорта Белоцерковская полукарликовая содержание ИУК значительно увеличивалось, а АБК практически не изменялось (рис.

95, а, б). Аналогичные закономерности обнаружены В. А. Васюк [83] при инфицировании растений пшеницы грибами-некротрофами рода Septoria, а также И. В. Максимовым [325] после культивирования каллюсной ткани пшеницы in vitro с возбудителем твёрдой головни Tilletia caries.

У инфицированных растений ИУК, вероятно, грибного проис хождения, поскольку большинство видов патогенных грибов проду цируют этот фитогормон в количестве, значительно более высоком, чем растения [241]. Поэтому существенное повышение содержания ИУК в тканях чувствительного сорта может вызывать в структуре клеток изменения, которые содействуют быстрому проникновению гиф патогена.

Несколько иные закономерности обнаружены при изучении содержания цитокининов. В инфицированных проростках неустой чивого сорта уровень зеатина уменьшался, а зеатин-рибозида увели чивался. У устойчивого сорта уровень цитокининов практически не рис. 95. Изменение фитогормонального статуса в 10-дневных проростках устойчивого (Колумбия) и неустойчивого (Белоцерковская полукарликовая) сортов озимой пшеницы при заражении Fusarium graminearum:

а — содежание индолилуксусной кислоты;

б — содержание абсецизовой кислоты;

в — содержание зеатина;

г — содержа ние зеатин-рибозида Биорегуляция роста и развития растений изменялся (см. рис. 95, в, г). В литературе имеются данные, что у сортов пшеницы, чувствительных к заражению патогеном Septoria tritici, на начальных этапах развития инфекции содержание цито кининов существенно снижалось, а у устойчивых — увеличивалось, что свидетельствует об участии цитокининов в ответной реакции на биотический стресс [83]. Но в целом роль цитокининов в форми ровании взаимоотношений между растением и патогеном остаётся малоизученной. Известно также, что цитокинины могут повышать устойчивость растений к фитопатогенам, принимая участие в экспрессии генов защитных белков, а также в синтезе антибиоти ков, угнетающих развитие патогенных грибов [524]. Однако они негативно влияют на образование защитного барьера растений, снижая активность хитиназы и угнетая синтез фитоалексинов [137].

В проростках устойчивого к септориозу сорта озимой пшеинцы Диамант обнаружены анионные хитин-специфические изоформы пероксидазы, взаимодействующие с хитином фитопатогенных грибов и активирующие синтез лигнина в местах локализации гиф пато генного гриба [524]. ИУК может снижать активность пероксидазы и её отдельных изоформ, включая хитин-специфические. Это может быть одной из причин, почему повышение уровня ИУК при инфи цировании патогенными грибами способствует лучшему проникно вению фитопатогенов [524, 525].

Некоторые данные литературы [325, 524] свидетельствуют о значительном накоплении АБК в тканях растений, инфицированных патогенами. Считается, что этот фитогормон индуцирует синтез стрессовых белков, принимающих участие в формировании устойчи вости растений к биотическим стрессам. Вероятно, формирование устойчивости зависит от многих факторов, в частности, от соотно шения между отдельными фитогормонами и активностью ферментных систем, влияющих на их синтез и метаболизм, ключевую роль среди которых играют изоформы пероксидазы.

Одним из компонентов защитной системы растений является пероксидаза, участвующая в синтезе лигнина, фитоалексинов, обра зовании белка клеточных стенок экстензина, окислении фенолов и активных форм кислорода, имеющих высокую фунгитоксичность [524, 760]. Индуктором этого фермента могут быть различные физические и биохимические факторы, а количественные и качественные изме нения его изоферментного состава связывают с адаптационными свойствами растений к действию неблагоприятных факторов среды [545, 760, 1087].

Нами установлено [145], что выращивание проростков пшеницы на жестком инфекционном фоне не вызывает появления новых изоформ рис. 96. Электрофоретическое разделение анионных изопероксидаз проростков озимой пшеницы:

а — надземная масса, б — корешки;

1 — Колумбия, контроль;

2 — Колумбия, заражение Fusarium graminearum;

3 — Белоцерковская полукарликовая, контроль;

4 — Белоцерковская полукарликовая, заражение Fusarium graminearum анионных и катионных пероксидаз в составе цитоплазматических белков надземной и корневой массы у обоих сортов (рис. 96, 97).

Но активность анионных пероксидаз (с Rf 0,1;

0,21;

0,26;

0, и 0,74) у проростков, заражённых F. graminearum, выражена сильнее (рис. 96, а), причём активность изоферментов у контрольных пророст ков устойчивого сорта Колумбия выше, чем у чувствительного сорта Белоцерковская полукарликовая. Анионные формы пероксидазы цитоплазматического белка корешков контрастных 14-дневных проростков пшеницы обоих сортов не отличались и обнаружили незначительное, по сравнению с контролем, повышение активности фракции с Rf 0,09.

Фракционирование в кислом геле катионных пероксидаз из надземной массы 14-дневных проростков (см. рис. 97, а) обнаружи ло активирование всех фракций при заражении фузариозом пророст ков озимой пшеницы сорта Колумбия по сравнению с незаражённым Биорегуляция роста и развития растений рис. 97. Электрофоретическое разделение катионных изопероксидаз проростков озимой пшеницы:

а — надземная масса, б — корешки;

1 — Колумбия контроль;

2 — Колумбия, заражение Fusarium graminearum;

3 — Белоцерковская полукарликовая, контроль;

4 — Белоцерковская полукарликовая, заражение Fusarium graminearum контролем и сортом Белоцерковская полукарликовая. Эти закономер ности более выражены для изопероксидаз корешков озимой пшени цы (см. рис. 97, б).

Катионные пероксидазы, имеющие основные свойства, выделя ются в межклеточное пространство, являющееся главным путём транспорта ИУК, где они взаимодействуют с этим фитогормоном и это может вызывать изменения баланса ауксинов [672, 760].

Возможно, при заражении фузариозом проростков пшеницы сорта Белоцерковская полукарликовая по сравнению с сортом Колумбия создавались благоприятные условия для накопления значительного количества ИУК, которая содействовала лучшему проникновению патогена и заражению им растений. Результаты измерения пероксидазной активности (табл. 76) показывают, что ферментативная активность цитоплазматического белка надземной массы контрольного варианта сорта Белоцерковская полукарликовая была ниже по сравнению с контрольными проростками озимой Таблица 76. Активность пероксидазы цитоплазматического белка 14-дневных проростков пшеницы (единицы активности в 1 мг белка) Колумбия Белоцерковская полукарликовая Колумбия Белоцерковская полукарликовая пшеницы сорта Колумбия. Возможно, это одна из причин более низкой устойчивости этого сорта к грибу-патогену. Заражение фуза риозом активизировало пероксидазную активность проростков сорта Белоцерковская полукарликовая, однако по абсолютным значениям она была более низкой, чем у проростков озимой пшеницы сорта Колумбия при заражении.

Грибы также продуцируют фитогормоны, причём в количествах, значительно больших, чем высшие растения. Продуцируя излишек гормонов, они разрушают систему их инактивации в растениях, что может вызвать снижение устойчивости растений к любым стрессо вым воздействиям. При использовании регуляторов роста природ ного происхождения в связи с их гормональной природой экзоген но пополняется пул фитогормонов. Они также приводят к выравниванию гормонального баланса и повышению устойчивости растений.

Кроме того, согласно теории иммуногенеза [567], при защите от болезней, возбудители которых поражают растения на начальной стадии их развития (к этой группе относятся и болезни корневой системы пшеницы), особого внимания заслуживают способы, направ ленные на ускорение прохождения этих фаз их развития [768]. Таким образом, благодаря использованию регуляторов роста гормональной природы обеспечивается ускоренное прохождение растениями ранних, более чувствительных для возбудителей, фаз онтогенеза, что повы шает их устойчивость к болезням.

Биорегуляция роста и развития растений Образование папилл при церкоспорелёзной инфекции пшеницы и их роль в индукции устойчивости против болезни Папиллы — факторы устойчивости — исследованы ещё в 70—80 годы прошлого столетия на модельной патосистеме ячмень (Hordeum vulgare L.) — возбудитель мучнистой росы (Erysiphe graminis) [577, 1064, 1111].

Есть данные об их образовании при заражении злаков церкоспореллёзом (возбудитель Pseudocercosporella herpotrichoides) [953], гельминтоспориозом (Helminthosporium avena) [545], септориозом (Stagonospora nodorum) [683].

Количественные показатели папиллообразования— «количество образованных папилл» — используют для сравнения сортов по устой чивости [953] и при оценке эффективности индукторов устойчивости [854]. Но папиллы могут отличаться размерами [285, 577] и местопо ложением на листовой пластинке [853], что влияет на устойчивость.

Так, у сортов устойчивых против мучнистой росы, образуются большие и более плотные папиллы, чем у чувствительных [853]. Такие папил лы большей частью непроницаемые для возбудителя. Образованию папилл предшествует формирование «ореолов» — уплотнений клеточ ного строительного материала, который интенсивно синтезируется и поступает в места проникновения возбудителя после касания утол щённой гифы (апрессории) гриба клеточной стенки [545].

Мы исследовали особенности формирования папилл при заражении проростков озимой пшеницы грибом Oculimacula (О.) yallundae — возбу дителем церкоспореллёза [284, 285]. Для заражения использовали моноспоровый изолят гриба O. yallundae, который выращивали на картофельно-глюкозном агаре в чашках Петри в течение 1,5 мес.

Заражение проростков проводили методом агаровых дисков [285]. Для этого семена высевали в стерильный песок, проращивали, а на 10-й день вокруг проростков помещали колонизированные возбудителем агаровые диски так, чтобы они плотно охватывали колеоптили. Сверху присыпали стерильным песком, обеспечивая таким образом оптималь ные условия заражения. Опыт повторяли дважды. Образование папилл фиксировали на 18-е сутки после заражения.

Проростки выкапывали, отмывали от песка, отмечали визуальные симптомы болезни при их наличии. Колеоптиль и первый настоящий лист отделяли от растения, нижнюю, лишенную хлорофилла часть первого листа разрезали на кусочки 1—2 см, фиксировали смесью, состоящей из 90 % этанола: 74 % хлороформа: 10 % 3-хлоруксусной кислоты в течение 1—2 ч, окрашивали метиленовым синим 5 мин, промывали водой и просматривали под микроскопом при увеличении в 350 и 700 раз.

Несмотря на почти полное отсутствие в это время визуальных симптомов болезни, под микроскопом (350) наблюдали «инфекци онные подушечки», характерные для церкоспореллёзной инфекции (рис. 98).

рис. 98. Образование «инфекционных подушечек» на поверхности листовых влагалищ проростков озимой пшеницы сорта Колумбия при заражении церкоспореллёзной инфекцией (350) Удалив мицелий, обнаруживали под каждой «подушечкой»

дискретные зоны проникновения — скопление отверстий и папилл на поверхности клеток эпидермиса и их границах (рис. 99).

рис. 99. Зоны проникновения возбудителя церкоспореллёза на поверхности листовых влагалищ проростков озимой пшеницы сорта Колумбия (700) Биорегуляция роста и развития растений Для подсчёта количества отверстий (проникновений) и папилл препараты рассматривали под большим увеличением (700). Как правило, в поле зрения микроскопа попадала одна зона проникно вения. В каждой зоне проникновения наблюдали клетки разного типа (рис. 100). Среди них клетки с уже приобретённой устойчивостью против заражения, о чём свидетельствует утолщение оболочек в виде больших непроницаемых папилл (А), мёртвые некротические (Б) и живые клетки, покрытые отверстиями с «ореолами» и мелкими папил лами, функция которых ещё не определена (В).

рис. 100. Влияние церкоспореллёзной инфекции на формирование папилл в клетках проростков озимой пшеницы сорта Колумбия через 18 сут (700):

А — живые клетки с большими непроницаемыми папиллами;

Б — клетки, погиб шие в процессе некроза;

В — живые клетки, в которых активно формируются папиллы Непроницаемые папиллы более тёмные и плотные, чем мелкие. И образуются они преимущественно на границе двух соседних клеток, в то время как мелкие формируются чаще всего на поверхности клеток. Если индуцируется устойчивость, процесс заканчивается формированием больших непроницаемых папилл.

Если папиллы формируются медленно или они мелкие, клетка некротизируется и гибнет, проникновение патогена происходит успешно.

Механизмы, которые играют ведущую роль в защите проростков пшеницы против церкоспореллёза, должны действовать продолжи тельное время, поскольку, в отличие от других систем патоген — растение (например, ячмень — возбудитель мучнистой росы), процесс заражения пшеницы грибом O. yallundae происходит очень медленно.

По данным T. D. Murray и H. Ge [953], «инфекционные подушечки»

образуются лишь через 4 сут после заражения и только у чувстви тельных сортов. Только тогда возбудитель начинает проникать в ткани колеоптиля. Наибольшей активности процесс проникновения дости гает на 10-е сутки.

При отсутствии устойчивости начинается отмирание клеток, необходимое для проникновения возбудителя в клетку. Проявление вредного действия возбудителя, связанное с появлением некроза, чаще всего происходит на 28—30-е сутки, а сам процесс заражения при этом продолжается.

В наших исследованиях ПТМБ и КЕ-50 стимулировали образо вание папилл в качестве маркёров устойчивости (рис. 101), но этот процесс происходил не одинаково. При использовании ПТМБ отме чалось существенное увеличение общего количества папилл и коли чества больших непроницаемых папилл;



Pages:     | 1 |   ...   | 9 | 10 || 12 | 13 |   ...   | 17 |
 




Похожие материалы:

«Отдел по церковной благотворительности и социальному служению Русской Православной Церкви Региональная общественная организация поддержки социальной деятельности Русской Православной Церкви Милосердие Е.Б. Савостьянова Как организовать помощь кризисным семьям в сельской местности Опыт Курской областной организации Центр Милосердие Лепта Книга Москва 2013 1 УДК 364.652:314.6(1-22) ББК 60.991 С13 Серия Азбука милосердия: методические и справочные пособия Редакционная коллегия: епископ ...»

«Орловская областная публичная библиотека им. И. А. Бунина БИБЛИОТЕЧНО- ИНФОРМАЦИОННОЕ ПОЛЕ АГРАРИЕВ Орел 2010 ББК 78.386 Б 59 Библиотечно-информационное поле аграриев : методико-информацион- ный сборник / Орловская обл. публ. б-ка им. И. А. Бунина ; [сост. Е. А. Су- хотина]. – Орел : Издатель Александр Воробьёв, 2010. – 108 с. В настоящее время наблюдается резкое увеличение интереса специалистов агро промышленного комплекса к проблемам использования возможностей информационно коммуникационных ...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования КРАСНОЯРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПЕДАГОГИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ им. В.П. Астафьева ПОЛЕВАЯ БОТАНИКА МОРФОЛОГИЯ И СИСТЕМАТИКА ЦВЕТКОВЫХ РАСТЕНИЙ. ОСНОВЫ ФИТОЦЕНОЛОГИИ Учебное пособие Электронное издание КРАСНОЯРСК 2013 ББК 28.5я73 УДК 58 П 691 Составитель: Н.Н. Тупицына, доктор биологических наук, профессор Рецензенты: А.Н. Васильев, доктор ...»

«Департамент культуры города Москвы Государственный Дарвиновский музей КАТАЛОГ КОЛЛЕКЦИИ РЕДКАЯ КНИГА БОТАНИКА Москва 2013 ББК 79л6 К 95 Государственный Дарвиновский музей Составители: заведующая сектором Редкая книга В. В. Миронова, старший научный сотрудник Э. В. Павловская, заведующая справочно-библиографическим отделом О. П. Ваньшина Фотограф П. А. Богомазов Редакторы: Н. И. Трегуб, Т. С. Кабанова Каталог коллекции Редкая книга. Ботаника / cост. В. В. Миронова, Э. В. Павловская, О. П. ...»

«С.-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ В. С. ИПАТОВ, Л. А. КИРИКОВА ФИТОЦЕНОЛОГИЯ Рекомендовано Министерством общего и профессионального образования Российской Федерации в качестве учебника для студентов высших учебных заведений, обучающихся по направлению и специальности Биология САНКТ-ПЕТЕРБУРГ ИЗДАТЕЛЬСТВО С.-ПЕТЕРБУРГСКОГО УНИВЕРСИТЕТА 19 9 7 УДК 633.2/3 И76 Рецензенты: д-р биол. наук В. И. Василевич (БИН РАН), кафедра бо таники и экологии растений Воронежского университета (зав. ...»

«Петра Ньюмейер – Натуральные антибиотики ЗАЩИТА ОРГАНИЗМА БЕЗ ПОБОЧНЫХ ЭФФЕКТОВ МИР КНИГИ ББК 53.52 Н92 Petra Neumayer NATRLICHE ANTIBIOTIKA Ньюмейер, Петра Н 92 Натуральные антибиотики. Защита организма без побочных эффектов. / Пер. с нем. Ю. Ю. Зленко — М.: ООО ТД Издательство Мир книги, 2008. — 160 с. Данная книга является уникальным справочником по фитотерапии. Автор простым и доступным языком излагает историю открытия натуральных антибиотиков, приводит интересные факты, повествующие об их ...»

«Министерство сельского хозяйства Российской Федерации ФГБОУ ВПО Вологодская государственная молочнохозяйственная академия имени Н.В. Верещагина Первая ступень в науке 2 часть Сборник трудов ВГМХА по результатам работы II Ежегодной научно-практической студенческой конференции Экономический факультет Вологда – Молочное 2013 ББК: 65.9 (2Рос – в Вол) П 266 Редакционная коллегия: к.э.н., доцент Медведева Н.А.; к.э.н., доцент Юренева Т.Г.; к.э.н., доцент Иванова М.И.; к.э.н., доцент Бовыкина М.Г.; ...»

«И.П. Айдаров, А.И. Корольков ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ КОМПЛЕКСНЫХ МЕЛИОРАЦИЙ В РОССИИ МОСКВА, 2003 1 УДК В книге на основании обобщения результатов многолетних опытно-производственных и теоретических исследований и имеющегося опыта рассмотрены проблемы природопользования в сфере АПК и особенности природно-хозяйственных условий экономических районов. Дан анализ изменения основных свойств природных ландшафтов при трансформации их в агроландшафты. Выявлены причинно-следственные связи, на основании ...»

«Управление по охране окружающей среды Пермской области Пермский государственный университет Пермский государственный педагогический университет Жемчужины Прикамья (По страницам Красной книги Пермской области) Пермь 2003 УДК 574 ББК 28.088 Ж53 ЖЕМЧУЖИНЫ ПРИКАМЬЯ (По страницам Красной книги Пермской области) Издание предназначено для школьников, изучающих биологию и эко- логию в средних школах и лицеях по всем действующим программам, в ка честве регионального материала, а также в учреждениях ...»

«Министерство сельского хозяйства Российской Федерации Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Пермская государственная сельскохозяйственная академия имени академика Д.Н. Прянишникова ИННОВАЦИОННОМУ РАЗВИТИЮ АПК – НАУЧНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ Сборник научных статей Международной научно-практической конференции, посвященной 80-летию Пермской государственной сельскохозяйственной академии имени академика Д.Н. Прянишникова (Пермь 18 ноября 2010 года) Часть ...»

«МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РЕСПУБЛИКИ БАШКОРТОСТАН Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования БАШКИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ООО БАШКИРСКАЯ ВЫСТАВОЧНАЯ КОМПАНИЯ НАУЧНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ УСТОЙЧИВОГО ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ И РАЗВИТИЯ АПК Часть III НАУЧНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ УСТОЙЧИВОГО РАЗВИТИЯ ЖИВОТНОВОДСТВА И ПЧЕЛОВОДСТВА ВЕТЕРИНАРНАЯ НАУКА – ПРОИЗВОДСТВУ Материалы всероссийской ...»

«Министерство сельского хозяйства РФ Департамент научно-технологической политики и образования Министерство сельского хозяйства Иркутской области Иркутская государственная сельскохозяйственная академия Аграрный университет, Краков, Польша Монгольский государственный сельскохозяйственный университет Белорусская государственная сельскохозяйственная академия Казахский национальный аграрный университет ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ БЕЗОПАСНОСТЬ И ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ АГРАРНОГО ПРОИЗВОДСТВА ЕВРАЗИИ Материалы ...»

«МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ АЛТАЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ Е.Г. Парамонов, А.А. Маленко ОСНОВЫ ЛЕСОВОДСТВА И ЛЕСОПАРКОВОГО ХОЗЯЙСТВА Учебное пособие Барнаул Издательство АГАУ 2007 УДК 634.0.2.(635.91) Парамонов Е.Г. Основы лесоводства и лесопаркового хо зяйства: учебное пособие / Е.Г. Парамонов, А.А. Маленко. Бар наул: Изд-во АГАУ, 2007. 170 с. Учебное издание ...»

«МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ АЛТАЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ Е.Г. Парамонов, А.П. Симоненко ОСНОВЫ АГРОЛЕСОМЕЛИОРАЦИИ Учебное пособие Барнаул Издательство АГАУ 2007 УДК 634.0.2.(635.91) Основы агролесомелиорации: учебное пособие / Е.Г. Пара монов, А.П. Симоненко. Барнаул: Изд-во АГАУ, 2007. 224 с. В учебном издании приведены основные положения, рас крывающие ...»

«издательство ВАЛЕНТИН Владивосток Издательство Валентин 2012 УДК 94(571.6) ББК 63.3 П13 Пак В. П13 Земля вольной надежды. Книга 1. Очерки дореволюци- онной истории Надеждинского района / В. Пак. – Вла- дивосток: Валентин; 2011. – 216с. ISBN 978-5-9901711-5-2 Земля Вольной Надежды раскрывает страницы истории На- деждинского района. Повествование охватывает в основном период с середины ХIХ века по 1917 год, когда шло заселение далёкой окраи ны, развивающей российскую государственность с момента ...»

«5 Turczaninowia 2002, 5(3) : 5–114 СИСТЕМАТИЧЕСКИЕ ОБЗРОРЫ УДК 582.683.2(47) В.И. Дорофеев V. Dorofeyev КРЕСТОЦВЕТНЫЕ (CRUCIFERAE JUSS.) ЕВРОПЕЙСКОЙ РОССИИ CRUCIFERAE OF EUROPEAN RUSSIA Предлагаемый Вашему вниманию список сем. Cruciferae Европейской России является второй большой попыткой познакомить читателей Turczaninowia с представителями европейских крестоцветных. Первая работа, опубликованная в 3 выпуске за 1998 год, касалась крестоцветных Средней полосы европейской части Российской ...»

«ЧТЕНИЯ ПАМЯТИ АЛЕКСЕЯ ИВАНОВИЧА КУРЕНЦОВА A. I. Kurentsov's Annual Memorial Meetings _ 2011 вып. XXII УДК 595.7.001 А.И. КУРЕЦОВ: ДНЕВНИК ОБ ЭКСПЕДИЦИИ В УССУРИЙСКИЙ КРАЙ В 1928 ГОДУ Ю.А Чистяков Биолого-почвенный институт ДВО РАН, г. Владивосток Приведены дневниковые записи А.И. Куренцова за время его шестимесячной экспедиции в Уссурийский край в 1928 г. Записи содержат данные о растениях и растительности, насекомых, птицах и других животных, встреченных А.И. Куренцовым во время экскурсий, ...»

«МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ АЛТАЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ Н.Д. ОВЧАРЕНКО, О.Г. ГРИБАНОВА БИОЛОГИЯ ЖИВОТНЫХ УЧЕБНОЕ ПОСОБИЕ Барнаул Издательство АГАУ 2012 УДК 574. (072) Рецензенты: д.б.н., профессор, зав. кафедрой экологии Алтайского государст венного университета Г.Г. Соколова; к.б.н., доцент кафедры генетики и разведения сельскохозяйствен ных ...»

«1 Основы идеологии белорусского государства Под общей редакцией профессора С.Н. Князева и профессора С.В. Решетникова МИНСК 2004 2 УДК ББК И Авторский коллектив: кандидат юридических наук, профессор Князев С.Н., доктор политических наук, профессор Решетников С.В., доктор юридических наук, профессор Василевич Г.А., доктор политических наук, профессор Земляков Л.Е., кандидат философских наук, доцент Денисюк Н.П., кандидат политических наук, доцент Антанович Н.А., доктор философских наук, ...»






 
© 2013 www.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.