WWW.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 

Pages:     | 1 |   ...   | 8 | 9 || 11 | 12 |   ...   | 17 |

«Национальная академия наук Украины Институт микробиологии и вирусологии им. Д. К. Заболотного Институт биоорганической и нефтехимии Межведомственный ...»

-- [ Страница 10 ] --

В то же время другими исследователями на семенах различных растений было установлено, что в ранний предростовой постэмбрио нальный период биосинтезу мРНК предшествует биосинтез белка, причём его скорость и спектр синтезированных белков находятся в прямой зависимости от гидратационных способностей зародышей (оводнённости семян) и продолжительности жизни резервных мРНК.

В этих работах было доказано участие в инициации белкового синте за предобразованных (отложенных в запас в позднем эмбриогенезе) мРНК. Вопрос о соотносительной роли резервных и новосинтезиро ванных рРНК в инициации биосинтеза белка в раннем постэмбрио генезе по сравнению с мРНК менее изучен. Приведённые подробно данные изложены в монографии Н. В. Обручевой [978], а структура и физиологическая роль запасных мРНК описаны М. А. Айтхожиным и соавт. [5].

Неизученным остаётся вопрос: происходит наблюдаемое увели чение синтеза мРНК и рРНК в ранний период постэмбриогенеза, резко возрастающее во времени, за счёт усиления активности генов или же за счёт увеличения числа их копий путём амплификации?

Основанием для постановки такого вопроса служат данные об обна ружении синтеза ДНК в зародышах растений в раннем постэмбрио генезе [802], амплификации структурных и рибосомных генов в разных эукариотических организмах на ранних этапах их развития [108, 219, 365, 472, 1101], а также тот факт, что уже в первые сутки прорастания семян фасоли рост зародышевой оси происходит не за счёт клеточного деления (т. е. увеличения числа клеток, связанного с репликацией ДНК), а вследствие растяжения клеток (удлинения) её гипокотиля, при котором репликативный синтез ДНК не проис ходит [366, 492, 1135, 1136].

Основываясь на результатах наших исследований и данных лите ратуры [425], мы провели исследования по изучению роли предсу Биорегуляция роста и развития растений ществующих и новосинтезированных мРНК и рРНК в процессах биосинтеза белка на ранних этапах постэмбриогенеза, а также меха низмов увеличения во времени уровня экспрессии генов в процессе роста и развития зародышей, определили некоторые механизмы действия на генетическом уровне регуляторов роста.

В проведённой работе использовали следующие физиологически активные соединения [302, 424—428].

ивин — синтетический аналог фитогормонов, химическое назва ние N-оксид 2,6-диметилпиридина, регулятор роста овощных и техни ческих культур, цветов.

биолан — естественный регулятор роста растений широкого спек тра действия, является продуктом жизнедеятельности грибов микромицетов, выделенных из корневой системы женьшеня. Препа рат разрешен для обработки семян и опрыскивания посевов растений зерновых, зернобобовых, технических и кормовых культур.

Эмистим с — спиртовой экстракт грибов-микромицетов с широ ким спектром действия, применяется при выращивании 25 культур.

радостим — новая композиция естественных регуляторов роста растений с биозащитным эффектом для обработки семян.

биосил — комплекс регуляторов роста растений.

Аверком — комплекс антибиотика аверкома с физиологически активными веществами (ауксинами, гиббереллинами и цитокининами, а также аминокислотами, липидами, в том числе жирными кислота ми);

антибиотик продуцируется штаммом Streptomyces avermitilis УКМ Ас-2179 [248], селекционированным в отделе общей и почвенной микробиологии ИМВ НАН Украины [385]. Положительно влияет на микробные ценозы почвы [56].

Комплексные микробные препараты были созданы на основе высо коэффективных штаммов азотфиксирующих микроорганизмов — микро симбионтов сои (Bradyrhizobium japonicum УКМ В-6018 и Bradyrhizobium japonicum УКМ В-6035) и фосфатмобилизующего штамма Bacillus megaterium УКМ В-5724, селекционированных сотрудниками отдела общей и почвенной микробиологии ИМВ НАНУ [308, 386].

Для изучения поставленных в работе вопросов применяли следу ющие препараты:

1. -Аманитин (-Ам) фирмы «Sigma Aldrich» (США), избира тельно выключающий экстраядрышковый синтез РНК (т. е. синтез мРНК) [633, 795, 1031];

2. Актиномицин D (АD) фирмы «Sigma Aldrich» (США), выклю чающий при незначительной концентрации преимущественно синтез РНК в ядрышках (т.е. синтез рРНК), но не ингибирующий синтез и выход в цитоплазму мРНК [1002];

3. Афидиколин (АФ) фирмы «Fluka» (Швейцария), избирательно выключающий катализируемый ДНК полимеразой -репликативный синтез ДНК, но не затрагивающий процесса амплификации ДНК [588, 1066].

На рис. 85 представлена увеличенная в размере зародышевая ось семени фасоли, в которой различают (сверху вниз) первичные лист, эпи- и гипокотиль (стебель) и корень.

рис. 85. Строение зароды- размеров и массы зародыша и заверша шевой оси семян фасоли: ется проклевыванием семени (выход а — первичный лист;

б — эпикотиль;

в — первичный Если первый этап — поступление воды, стебель (гипокотиль);

г — зародышевый корень присуща только живым и связана с общим возрастанием метаболиз ма семени.

Следует подчеркнуть, что проклёвывание семени (24 ч) проис ходит за счёт растяжения клеток гипокотиля, которое начинается в его базальной части — у корня и постепенно перемещается к семядольному узлу. При этом клетки не растягиваются сразу до их окончательной длины, а наблюдается несколько периодов наиболее энергичного роста. Спецификой роста гипокотиля является огра ниченный, заканчивающийся к 8-м суткам после замачивания, рост, обеспечивающий выполнение основной функции — выноса семя долей со стеблевой почечкой из почвы.

Биорегуляция роста и развития растений В корневой меристеме первые митозы обнаруживаются, как прави ло, в уже проклюнувшихся семенах, т. е. рост корня начинается примерно через сутки (через 25—28 ч) после замачивания практически одновременной инициацией деления и растяжения. В первые 24 ч длина клеток и их количество в ряду не изменяются, а размеры зон (меристема — 0,5 мм и растяжение — 1 мм) и соответственно размер корня (около 1,5 мм), свойственные сухому семени, остаются посто янными. Через 32 ч длина зон меристемы и растяжения увеличивает ся вдвое. Зона зрелых клеток формируется примерно через 36 ч и составляет 0,8 мм. Через 44 и 72 ч прорастания стабилизируется размер соответственно зон меристемы (1,4 мм) и растяжения (5 мм).

В стеблевой меристеме клетки начинают делиться лишь через 36—40 ч, а в листе — через 48 ч. Установлена определённая после довательность инициации ростовых процессов, отражающая особен ности развития отдельных органов зародышевой оси: гипокотиль, зародышевый корень, лист.

Приведённые результаты послужили основой для выводов по полученным нами данных о синтезе РНК, белков и ДНК.

На рис. 86, а видно, что практически до 12 ч после начала прорастания семян фасоли в клетках зародышевой оси не происходит синтеза мРНК, который начинается только после 18 ч и непрерывно нарастает до 36 ч инкубации (кривая 1). -Ам вызывает практически полное подавление синтеза мРНК на протяжении всего периода инку бации семян растений (кривая 2), что вполне согласуется с данными других авторов о полном подавлении синтеза мРНК -Ам и в клет ках других организмов [633, 795]. Нами отмечено частичное, видимо неспецифическое, ингибирование синтеза мРНК АD (кривая 3), хотя по данным литературы [1002] он избирательно ингибирует только синтез рРНК и не затрагивает (при используемой нами его концен трации) синтеза и перехода в цитоплазму мРНК. Очевидно, АD обла дает меньшей избирательной специфичностью по сравнению с -Ам как ингибитор синтеза какого-либо одного класса РНК.

Подобная картина временной кинетики синтеза мРНК получена нами при изучении синтеза рРНК (рис. 86, б): до 12 ч отсутствие синтеза, включение синтеза с 18 ч и дальнейший резко возрастающий подъём синтеза до 36 ч инкубации семян (кривая 1). По чувствитель ности синтеза рРНК к ингибиторам -Ам и АD наблюдается проти воположная картина по сравнению с мРНК: слабое, очевидно также неспецифическое, ингибирование -Ам мРНК (кривая 2) и почти полное ингибирование АD синтеза рРНК (кривая 3).

Полученные нами данные по синтезу мРНК и рРНК информа тивны для сопоставления их с данными по синтезу белка (рис. 86, в). Уже через 6 ч в клетках зародышевой оси начинается синтез белка и каждые 6 ч (12 ч, 18 ч и т. д.) уровень биосинтеза белка возрас тает примерно вдвое (кривая 1), тогда как фактически только с 18 ч начинается синтез мРНК и рРНК. Интересно и то, что до этого времени практически не наблюдается влияния на синтез белка ни -Ам, ни АD (кривые 2 и 3), т. е. синтез белка в этот промежуток времени происходит, вероятно, на предсуществующих (запасённых) мРНК и рРНК. Этот вывод соответствует данным о том, что суще имп./(мин•мг РНК•10-3) имп./(мин•мг РНК•10-4) имп./(мин•мг белка•10 ) - рис. 86. Кинетика включения Н-уридина в поли-А РНК (а), поли-А- РНК (б) и 14С-лейцина в белки (в) клеток зародышевой оси семян фасоли:

1 — контроль;

2 — в присутствии -Ам;

3 — в присутствии АD;

г — дот-блотинг препаратов 33Р-поли-А+РНК (столбик 1) и 33Р-поли-А- РНК (столбик 2), полу ченных из зародышевой оси через 24 ч после начала прорастания семян фасоли, с препаратами ДНК, выделенными из зародышевых осей соответственно из сухих семян (контроль) и через 6;

12;

18;

24;

30 и 36 ч после начала прорастания семян (опыт) Биорегуляция роста и развития растений ствуют короткоживущие и долгоживущие мРНК, период полужизни которых исчисляется от нескольких минут до нескольких часов и даже суток [94, 95, 219, 493, 1031].

По замедлению дальнейшего подъёма после 18 ч биосинтеза белка под влиянием -Ам и АD относительно контроля можно предполо жить, что через 24 ч в синтезе белка участвуют уже и новосинтезиро ванные мРНК и рРНК, синтез которых подавляется соответственно -Ам и АD. Следует также отметить, что длительное торможение биосинтеза белка, опосредованное угнетением синтеза мРНК и рРНК, приводит к аномалии роста и развития зародышевой оси, что прояв ляется в замедлении роста гипокотиля примерно в 4 раза.

Таким образом, данные наших исследований чётко показали, что в ранний переходный период от состояния покоя к активному росту и развитию при прорастании семени для инициации ростовых процес сов используются отложенные в запас в позднем эмбриогенезе специ фические продукты экспрессии генов (транскрипты в виде мРНК и рРНК), необходимые для экстренного синтеза определённого коли чества специфических белков, без которых невозможно было бы дальнейшее развитие (приведение в действие) в клетках генетической программы роста и развития зародышевого организма.

Синтез и отложение в запас в клетках зародышевой оси этих транскриптов при вхождении семян в состояние физиологического покоя в эмбриогенезе осуществляются, очевидно, для обеспечения начальных этапов генетического контроля выхода зародышей из «спящего» в физиологически активное состояние и поступательно го развертывания независимой уже от генетических факторов мате ринского организма автономной генетической программы постэм брионального роста и развития зародышей с постепенным формированием из них растений со специализированными высоко дифференцированными клетками, органами и тканями.

С помощью -Ам исследован также соотносительный вклад пула запасённых и новосинтезированных мРНК в прорастание семян Arabidopsis и в процессы роста и развития зародышей этих растений [1031]. Показано, что даже при избыточной дозе -Ам происходит выход корешка наружу из семени, но дальнейшие рост и развитие зародышей прекращаются. Сделан вывод о том, что для дальнейшего развития зародыша необходима транскрипция мРНК de novo. Однако прорастание семян полностью блокируется при подавлении биосинтеза белка ингибитором трансляции циклогек симидом, что доказывает, по мнению авторов, участие пула запа сённых мРНК в белковом синтезе прорастающих семян и в реали зации процесса выхода корешка наружу из семени. Полученные в этих исследованиях данные позволили авторам сделать следующие выводы:

— в регуляции скорости прорастания принимают участие регу ляторные факторы, синтез которых de novo подавляется -Ам;

— наблюдаемое 15-кратное снижение чувствительности к гиббе релловой кислоте прорастающих семян под влиянием -Ам свиде тельствует о приоритетной роли этого фитогормона в процессах прорастания;

— наряду с запасёнными белками в зародышах в эмбриогенезе необходим синтез de novo ферментов, участвующих в мобилизации резервов, возобновлении метаболической активности после физио логического покоя и обеспечении адаптивных реакций зародышей к стрессовым факторам (например, к водному стрессу);

— прорастание семян происходит с помощью генетической программы, заложенной при созревании, составляющими которой являются как использование в процессах инициации прорастания отложенных в запас при созревании мРНК и белков, так и последо вательная активация генов синтеза de novo аналогичных и других белков, обеспечивающих процесс прорастания семян.

Всё ещё малоизученными остаются механизмы инициации экспрессии генов и наблюдаемое быстрое возрастание уровня экспрессии генов в зародышах растений в ранний постэмбриональ ный период. По мере «истощения» резервов, необходимых для запу ска первоначального синтеза белков, включаются генетически запро граммированные механизмы последующей быстрой наработки нового или дополнительного массива продуктов экспрессии генов.

К числу таких механизмов относят усиление активности генов и увеличение числа их копий (амплификацию). Последний механизм часто используется в период развития зародышей многих эукарио тических организмов [108, 219, 472, 1101].

Мы предположили, что на начальном этапе развития зародыше вой оси фасоли, когда ещё не включены репликативные процессы, относящиеся к процессам увеличения численности клеток и направ ляемые на создание дифференцированных и специализированных клеток и органов, возможно, используется механизм амплификации генов для экстренной наработки продуктов экспрессии генов. На начальном этапе постэмбриогенеза рост зародышевой оси, как уже отмечалось, происходит не за счёт увеличения числа клеток, а вслед ствие растяжения клеток гипокотиля [366, 492]. Для проверки этого предположения мы использовали афидиколин, который «выключает»

репликативный синтез (если таковой имеется) и не влияет на процесс амплификации генов [588, 1066].

Биорегуляция роста и развития растений Рис. 86, г свидетельствует о резком возрастании во времени в геномной ДНК последовательностей, гибридизирующих с Р-гибридизационными зондами мРНК и рРНК (столбики 1, 2).

Афидиколин до 30 ч, не снижает увеличения генетического мате риала, гибридизующегося с продуктами транскрипции (во всех случаях для гибридизационного анализа использовали Р-транскрипты, выделенные из зародышевой оси через 24 ч прорастания семян). И только спустя 30 ч после начала прорас тания семян включаются механизмы репликации ДНК, ингибируе мые афидиколином. В противоположность этому ДНК, полученная из исходных сухих семян (контроль), содержит меньше копий после довательностей, гибридизующихся с 33Р-РНК-зондами.

Эти опыты показали, что в зародышах растений, как и в других эукариотических зародышах, на начальных этапах развития используются механизмы амплификации структурных и рибосомальных генов для интен сивной наработки конечных продуктов экспрессии генов (белков).

В проведённой работе нам также удалось показать, что стимуля торы роста растений (в частности, ивин) ускоряют ростовые процес сы не дополнительным увеличением числа копий генов в зародышах растений, а их активизацией (табл. 70).

Таблица 70. включение 3н-уридина в суммарную рнк цитоплазмы клеток зародышевой оси в динамике прорастания семян фасоли Время, ч Контроль, имп./(мин · мг РНК) Ивин (10—8 М), имп./(мин · мг РНК) Стимуляторы роста способствуют максимальному раскрытию генетического потенциала клеток растений [302]. Это происходит за счёт усиления активности промоторных и энхансерных (усиливающих уровень и скорость транскрипции) последовательностей ДНК и уско рения формирования в промоторах растений инициирующих транс крипционных комплексов (рис. 87) из элементов регуляторных обла стей генов, РНК-полимеразы и транс-факторов белковой природы.

Такие комплексы состоят из 70 и более белков (поэтому их называ ют транскриптосомой по аналогии с рибосомой) [1018].

Таким образом, регуляторы роста растений не затрагивают базо вые генетические процессы (амплификацию генов), а, ускоряя процес сы экспрессии генов, сокращают сроки их протекания.

рис. 87. Схематическое изображение инициирующего транскрипционного комплекса [1018] Несмотря на достигнутые успехи в использовании регуляторов роста в растениеводстве, строгие научно обоснованные нормативы или «рецепты» их применения не предложены из-за ограниченности знаний о механизме их действия (влиянии каждого из соединений на метаболизм клеток на протяжении всего периода онтогенеза расте ний, особенностях действия соединения в зависимости от его концен трации и условий выращивания, влияния регуляторов на наследствен ные свойства растений и др.) [162, 565—567].

В контексте перечисленных общих направлений определения регуляторных свойств соединений первостепенным является изучение следующих вопросов: действуют ли экзогенные регуляторы роста (природные или синтетические), а также другие химические соеди нения непосредственно на функции генов или же через каких-то посредников? Каким образом синтетические химические соединения с совершенно несвойственной для фитогормонов структурой (напри мер, триамелон [757]) действуют порой так же, как и природные соединения (по интегральным конечным результатам)? Почему во многих случаях синтетические соединения оказывают выраженный физиологический эффект при значительно более низких концентра циях (некоторые даже при концентрации 10—12 М), чем природные соединения (от 10—5 до 10—8 М) ?

В поисках ответов на эти вопросы мы сочли целесообразным представить некоторые литературные и собственные данные, касаю щиеся этих проблем, а также сложившиеся в науке представления о принципах формирования в клетках растений ответных реакций на различные воздействия и их механизмах. Несомненно, к числу фактов, связанных с выяснением указанных вопросов, можно отнести обна ружение в клетках растений резкого увеличения концентрации эндо Биорегуляция роста и развития растений генного пула фитогормонов и изменения соотношения фитогормонов под влиянием экзогенных регуляторов роста (природных или синте тических) [288, 299]. Эти данные подтверждают и результаты наших исследований, показывающие, что:

— присутствие в среде регуляторов роста является мощным импульсом развития у растений вегетативных органов (рис. 88—90), что, по-видимому, можно объяснить индуцированием экзогенны ми регуляторами синтеза фитогормонов, контролирующих эти процессы;

— действие синтетических регуляторов на рост гипокотиля у декапитированных (т. е. лишённых верхушечной части) зародышевых осей семян растений отсутствует [1136];

— стимулирующего действия регуляторов роста на одноклеточные организмы (бактерии, дрожжи), у которых регуляция роста иная, чем у растений, нами не обнаружено;

— в работах с культурами клеток и тканей растений in vitro на питательных средах для индуцирования тех или иных морфогенети ческих процессов можно с успехом использовать вместо одного или даже двух фитогормонов какое-либо одно отобранное в процессе скрининга химическое соединение [471, 1134].

В предлагаемой ниже концепции приведённые наши и данные литературы в цепочке механизма действия регуляторов роста растений рис. 88. Влияние зеастимулина на рост проростков кукурузы (для разведения использовали маточный раствор регулятора роста, содержащий 1 мг действующего вещества в 1 мл воды):

а — контроль (вода);

б — зеастимулин в разведении 10 -6;

в — зеастимулин в разведении 10- рис. 89. Влияние потейтина в рис. 90. Влияние радостима на разведении 10 -6 на рост растений- укоренение черешков листа фасоли регенерантов картофеля на средах (для разведения исполь зовали (для разведения ис пользовали маточный раствор регулятора роста, маточный раствор регулятора роста, содержащий 1 мг действующего содержащий 1 мг действующего вещества в 1 мл воды):

а — с кинетином 10-8 М;

б — потейтин вместо кинетина в 10-7 разведения мы рассматриваем как основные. Суть этой концепции сводится к следующему: регулятор(ы) роста растений активирует(ют) транс факторный(ые) белок(ки) по принципу аллостерического эффекта (проявление сродства структуры регулятора роста к структуре или части структуры активного центра белковой молекулы трансфактора).

В результате изменения пространственной структуры (а возможно и опосредованной каталитическим действием регулятора роста фермен тативной модификации трансфактора) происходит активизация трансфактора(ов), что ускоряет формирование инициаторного транс крипционного комплекса в регуляторной части (промоторе) гена(ов) синтеза фитогормона(ов) и далее по цепочке активации генов синте за и других фитогормонов, образующих специфический на действие регулятора баланс фитогормонов. В свою очередь этот комплекс Биорегуляция роста и развития растений фитогормонов включает или активирует гены синтеза структурных или функциональных белков, либо одновременно тех и других в случае стимуляции регулятором(ами) сбалансированного роста и развития организма растений.

В пользу описанной последовательности приведённых механиз мов реализации сигналов регулятора(ов) роста свидетельствуют следующие факты:

— у растений именно фитогормоны являются посредниками между сигналами внешней (или внутриклеточной) среды и генами в формировании клетками соответствующих ответных реакций;

— данные об увеличении концентрации и изменении баланса эндогенного комплекса фитогормонов под влиянием экзогенных регу ляторов приведены нами выше;

— механизм опосредованной (через специфические трансфакто ры белковой природы) регуляции экспрессии генов фитогормонами чётко доказан в работах многих авторов [101, 294]. В данном случае структура фитогормонов и трансфакторов подходят друг к другу как «ключ к замку»;

— по аналогии с приведёнными аргументами логично предпо ложить, что сигналы регуляторов роста, как и другие внешние или внутриклеточные сигналы, опосредуют свое действие через регуля торную систему фитогормонов.

Далее мы попытаемся дать более подробное обоснование неко торых положений сформулированной нами концепции. Как отмечено выше, у растений существует двойственный контроль их роста и развития: генетический контроль и фитогормональная регуляция, тесно взаимодействующие между собой. Гены программируют синтез фитогормонов, а фитогормоны по принципу обратной связи регули руют активность генов синтеза структурных и функциональных белков. Вследствие активации одного из генов синтезa какого-либо фитогормона по цепочке происходит «включение» и других генов синтеза этого же фитогормона, а затем (синхронно) генов синтеза и иных фитогормонов, совместно образующих баланс фитогормонов, которые запускают каскад структурных генов, формирующих ответные реакции/процессы на то или иное воздействие [299, 951]. Такой баланс фитогормонов является кратковременным. Продолжительное присутствие в окружающей среде активатора генов синтеза фитогор монов (регулятора роста) может стабилизировать их баланс, в резуль тате чего фитогормоны будут продолжать действовать в том же соста ве под влиянием регулятора роста. Подтверждением этого является обнаруженное нами резкое замедление «старения» каллусов при их пассировании и длительном культивировании на средах с синтетиче скими регуляторами. Длительная задержка в смене баланса (ансамбля) фитогормонов стимулятором роста может привести к ускоренному увеличению размера растения (из-за избыточного синтеза структурных элементов клетки, обеспечивающих быстрый рост вегетативных орга нов) и запаздыванию или подавлению включения генов синтеза специфических (специализированных) белков, участвующих в заклад ке и формировании генеративных органов растения.

Учитывая то, что могут образовываться и смешанные пулы фито гормонов в ответ не на одно, а на два или несколько сигналов (например, на температуру и регулятор роста), весьма сложно опре делить истинный пул фитогормонов на то или иное воздействие. К этому следует добавить, что трудно также определить, какой из фито гормонов подвергается деструкции: находившийся до формирования пула в ответ на сигнал или же после реализации сигнала.

Известно, что все внешние воздействия либо сигналы (свет, темнота, тепло, холод, затопления, засуха, химические вещества, включая и регуляторы роста, засоление почвы или загрязнение её ионами тяжёлых металлов и др.) воспринимаются вначале рецеп торами или эффекторами клеток. Система рецепторов располагает ся как внутри клеток, так и на поверхности мембран. Рецепторы представляют собой сложные комплексы, содержащие многомерные белки. Очевидно, что узнавание рецепторами химических структур может быть специфичным, отчасти специфичным или неспецифич ным (т. е. вследствие образования случайных связей между хими ческим соединением и какой-то частью многомерной структуры рецептора). Другая возможность действия регуляторов роста — формирование комплекса между регулятором и активной частью молекул белка — трансфактора, минуя рецептор, благодаря случай но проявленному сродству (аллостерическому эффекту) какой-то части структуры трансфактора и регулятора роста (структура ДНК инертна для взаимодействия с регулятором роста), в результате чего меняется пространственная организация трансфактора. Это, веро ятно, и приводит к его/их активации и ускорению формирования инициаторных транскрипционных комплексов в промоторах генов синтеза фитогормонов. По нашему мнению, все поступающие извне сигналы клеток опосредуют свое действие именно через изменение пула (т. е. синтеза) соответствующих фитогормонов, а полученный биологический эффект достигается уже посредством включения либо выключения, либо же активации фитогормонами структурных генов, кодирующих функциональные белки, отвечающие за тот или Биорегуляция роста и развития растений иной процесс либо ответ в клетках (например, за ускорение роста и развития растений).

Само по себе попавшее в клетку чужеродное химическое соединение вряд ли сможет найти вслепую специфические точки приложения для формирования специфического ответа, являюще гося продуктом цепи последовательных реакций, программируемых не одним, а многими генами. Специфическое последовательное «включение» одних генов и «выключение» других «под силу» толь ко фитогормонам, которые узнают регулируемые ими гены «в лицо» и знают, когда и в какой последовательности их запускать, а какие выключать. Схема опосредованной через фитогормоны регуляции активности генов в зародышах растений представлена нами ранее [1136].

Другой аспект этой проблемы заключается в том, что отобранный в процессе скрининга для определённого периода развития химиче ский регулятор, в отличие от фитогормонов, вряд ли будет обладать такой же активностью на другом этапе развития. Инициация росто вого процесса происходит за счёт отложенных в запас мРНК и рРНК и последующего включения ограниченного количества ранних генов синтеза подобных классов РНК и синтеза на них ранних белков, участвующих в запуске и развёртывании генетической программы роста и развития растений.

Эти ранние (возможно примитивные) гены, очевидно, содержат относительно простые регуляторные последовательности и небольшой круг «обслуживающих» их трансфакторов (т. е. возможно у этих генов короткие промоторные и энхансерные последовательности, а может, отсутствуют энхансеры), которые воспринимают ограниченное коли чество регуляторных сигналов и экспрессируют ограниченное коли чество ранних, в основном регуляторных белков, которые обеспечи вают выключение ранних и включение средних генов уже с более сложной разветвлённой системой регуляции.

Таким образом, каждый период роста и развития растений характеризуется включением генов со всё более сложными обла стями регуляции и соответственно взаимодействующих со всё боль шим количеством трансфакторов, обеспечивающих регуляцию самих генов, межгенные взаимодействия, процессы дифференциа ции и специализации клеток, межклеточные и межорганные взаи модействия. Все гены и их регуляторные последовательности отли чаются первичной и пространственной структурой, поэтому отобранный при скрининге и случайно оказавшийся «подходящим»

регулятор роста на первом этапе развития вряд ли может оказать ся таким же эффективным на последующих этапах онтогенеза (за исключением регуляции генов синтеза каких-то общих для всех этапов развития структурных белков). Вероятно, идеальным было бы проводить дробный скрининг химических соединений через короткий интервал в процессе роста и развития. Известно, что именно такой подход используется в работах с культурами клеток и тканей растений in vitro. В этих работах [471] для индуцирования тех или иных морфогенетических процессов экспланты растений последовательно переносят с одной среды на другую с измененным составом стимуляторов морфогенеза (природных или синтетиче ских). С рассмотренных позиций можно объяснить и обнаружен ную нами разную сортовую чувствительность сельскохозяйственных растений к регуляторам роста. Причиной этого по-видимому, явля ется микрогетерогенность по генам в семействах «многосемействен ных» генов у сортов растений (т. е. небольшие различия в нукле отидных последовательностях и их регуляторных областях) и, соответственно, в структуре трансфакторов, обеспечивающих функ ции генов, проявляющих и не проявляющих сродство к регулято ру роста.

С высокой избирательностью действия регуляторов роста на активность генов можно связать и зависимость биологического эффекта от концентрации физиологически активных соединений [39, 425]. Превышение их концентрации (передозировка) может привести к несвоевременному (одновременному) включению средних или позд них генов, неспецифическому угнетению регуляторами функции окру жающих генов, оказавшихся мишенями негативного влияния на них регуляторов роста (ингибирования в этих генах энхансерных и акти вации сайленсерных последовательностей ДНК — ингибиторов транс крипции), нарушению межклеточных и органных взаимодействий, что может явиться причиной несбалансированного роста и развития зародышевого организма и далее формирования в дальнейшем фено типа растения, который определяется преобладанием работающих генов с позитивным ответом над негативным, либо наоборот, на действие регулятора роста. Опыт показывает, что использование композиций регуляторов роста обеспечивает сбалансированное разви тие растения.

Полученные данные и представления авторов о механизмах действия, а также описанные закономерности имеют важное значение для биотехнологии, в частности, для активации «нужных» и выклю чения «ненужных» генов при синтезе необходимых физиологически активных соединений.

Биорегуляция роста и развития растений Особенности изменений биосинтеза белка и пула мРНК в растениях под влиянием регуляторов роста Поиск и разработка новых относительно недорогих элементов экологически безопасных агротехнологий являются актуальными как в Украине, так и в мировом сельскохозяйственном производстве.

Многолетний опыт показывает, что самым перспективным из них является использование в сельском хозяйстве регуляторов роста расте ний, с помощью которых возможно не только сократить расходы на производство сельскохозяйственной продукции, но и увеличить выход количества с единицы площади и повысить качество сельскохозяй ственной продукции (т. е. поднять урожайность культур), а также усилить иммунитет (защитные свойства) растений при сокращении использования химических средств защиты, повысить засухо- и холо достойкость культурных растений, обеспечить создание лучших усло вий для симбиоза растений с микрофлорой почвы.

Реальными для производителей стали регуляторы роста растений, созданные в Институте биоорганической химии и нефтехимии НАН Украины [302, 425]. При проверке действия этих регуляторов перво очередное внимание было уделено выяснению механизма их действия на функции генетического аппарата клеток (экспрессию генов) с целью поиска соединений, безвредных для растительного организма и окружающей среды. Эти вопросы успешно решаются путём исполь зования результатов лабораторных и полевых опытов, подбора мини мальных экологически безопасных и в то же время эффективных доз регуляторов роста, изучения их влияния на развитие растений, а также на функции генов и в целом на наследственные характеристи ки растений.

Важным является изучение механизмов действия регуляторов на рост и развитие растений в ранний постэмбриональный период, чтобы понять, в каком направлении происходит развитие зародышей расте ний и если нужно — скорректировать эти процессы.

Целью этой работы стало изучение эффективности усвоения растениями азота из окружающей среды, уровня экспрессии генов, а также степень гомологии мРНК у растений, обработанных и необ работанных регуляторами роста и микробными препаратами на начальных этапах онтогенеза.

В мировом сельскохозяйственном производстве в качестве удобре ния широко используются неорганические соединения, содержащие азот. Однако эффективность их использования (поглощения) расте ниями от общего количества, внесённого в почву, невысокая (~ 30 %).

Химикаты, которые остаются в почве, накапливаются и наносят вред окружающей среде. Поэтому актуальной является разработка методов повышения эффективности поглощения и усвоения растениями таких соединений.

Полученные нами данные лабораторных и полевых опытов свиде тельствуют о том, что использование созданных в Институте биоор ганической химии и нефтехимии НАН Украины регуляторов роста растений (природных и синтетических) и созданных в Институте микробиологии и вирусологии НАНУ микробных препаратов способ ствует увеличению не только биомассы растений, но и повышению их производительности, сопровождающейся усвоением растениями дополнительных количеств разных соединений для построения клеточ ных и субклеточных структур.

К числу перспективных биопрепаратов относятся эмистим С и аверком, созданные на основе природных штаммов микроорганиз мов. Эти препараты были использованы для определения возмож ности повышения усвоения растениями неорганических соединений, содержащих азот, для синтеза биополимеров в лабораторных опытах.

В табл. 71 приведены данные относительно содержания белка в незрелых зернах растений бобовых в конце их вегетации. Наблюда ется тенденция увеличения содержания белка в зернах фасоли и гороха при использовании как отдельно, так и в сочетании эмистима С и аверкома. Эти данные были подтверждены также и увеличением содержания белкового азота.

В последующем было проведено изучение экспрессии генов у контрольных и опытных растений. В серии проведённых нами опытов с ивином, биоланом, радостимом было установлено следующее: уже на раннем этапе развития (при выходе семян из состояния покоя), когда включаются процессы биосинтеза РНК и белков, действие регуляторов роста опосредуется путём стимуляции синтеза как мРНК, так и рРНК, что приводит к увеличению белкового синтеза, в резуль тате чего ускоряются прорастание семян и процессы формирования органов растений (табл. 72).

Таблица 71. влияние регуляторов роста на синтез белка у фасоли и Вариант опыта Биорегуляция роста и развития растений Таблица 72. включение 3н-уридина в мрнк и ррнк цитоплазмы клеток зародышевой оси фасоли при нормальном и стимулированном Контроль, имп./(мин · мг РНК) Радостим, имп./(мин · мг РНК) Время, В отдельных опытах мы показали, что повышение синтеза РНК связано именно со стимуляцией транскрипции генов, а не за счёт увеличения их копий (амплификации) [534], т. е. регуляторы роста способствуют максимальному раскрытию генетического потенциала клеток растений. Это происходит, по нашему мнению, за счёт увели чения уровня и скорости транскрипции путём ускорения формиро вания в промоторах инициаторных транскрипционных комплексов из элементов регуляторных участков генов, РНК-полимеразы и транс факторов белковой природы.

Особенности действия регуляторов роста и микробных препара тов на экспрессию генов также изучали по степени гомологии мРНК в клетках контрольных и опытных растений сои в условиях предпо севной обработки семян этими препаратами. Результаты этих иссле дований представлены в табл. 73.

Таблица 73. исследование гомологии мрнк у сои при обработке регуляторами роста и микробными препаратами Bradyrhizobium japonicum Bradyrhizobium japonicum Bradyrhizobium japonicum Bradyrhizobium japonicum УКМ В-6018 + Bacillus megaterium Полученные результаты свидетельствуют о том, что на стадии цветения сои пул мРНК у обработанных препаратами растений отли чаются от мРНК контрольных растений. Наибольшие расхождения относительно контроля наблюдаются при использовании биосила и радостима (соответственно 76 % и 78 %). Меньшие отличия установ лены при использовании комплементарного штамма симбиотических азотфиксаторов Bradyrhizobium japonicum УКМ В-6018 (93 %). Приме нение комплекса препаратов приводит к уменьшению расхождений между контрольными и опытными растениями по популяциям мРНК.

Разницу в процентном отношении популяций мРНК опытных расте ний разных вариантов относительно контрольных можно объяснить тем, что эффект биологического действия каждого из регуляторов роста достигается за счёт опосредования его действия различными метаболическими путями, в основе которых лежит формирование специфического для каждого регулятора баланса фитогормонов.

Действительно, многочисленные данные литературы [294, 295, 299, 472, 593, 678, 897, 914, 937, 938, 951, 954, 991, 1017, 1019, 1052, 1053, 1119, 1145, 1146] свидетельствуют о том, что регуляторы роста опосредуют свое действие в клетках через создание (синтез) специфи ческих по отношению к своей структуре балансов фитогормонов, которые активируют разные каскады генов, ускоряющих онтогенез растений по разным метаболическим путям. Например, синтез аукси на ИУК может осуществляться из триптофана через индолил- пировиноградную, индолил-3-масляную кислоту, триптамин и индол 3-ацетальдоксим [897, 951, 972]. Опыты с ауксотрофными по триптофану мутантами растений показали, что биосинтез ИУК может также происходить триптофан-независимым путём из индола при участии предшественника индол-3-ацетонитрила под контролем неод нотипных групп генов [840, 951, 972]. Полученные нами результаты о разнообразии пула мРНК также подтверждают этот вывод.

В пользу этого вывода свидетельствуют также данные об изме нении популяций мРНК в процессе онтогенеза растений (например, в течение эмбриогенеза и раннего постэмбриогенеза) [755]. Авторы исследовали количественные и качественные характеристики препа ратов мРНК, выделенных из молодых и зрелых зародышей семян хлопчатника через 12 и 24 ч после начала проращивания семян, проводя гибридизацию синтезированной на этих препаратах кДНК с кДНК, которую получали на мРНК молодых зародышей. Были опре делены количественные и качественные отличия в процентном отно шении в составе специфических мРНК, полученных в эмбриогенезе и постэмбриогенезе, а также между мРНК на отдельных этапах эмбриогенеза и постэмбриогенеза.

Биорегуляция роста и развития растений Таким образом, данные литературы и этой работы свидетельству ют, что регуляция генетических процессов (экспрессии генов) в клет ках растений осуществляется по двум направлениям: 1) использова нием разных путей реализации генетической информации, зависимых от структуры регулятора;

2) опосредованностью действия регулятора роста через баланс эндогенных фитогормонов, специфический для каждого регулятора.

Изменение популяций функционально активных цитоплазматических мРНК в клетках растений под влиянием регуляторов роста и биотехнологические перспективы бесклеточных систем белкового синтеза В настоящее время для получения лекарственных препаратов пептидной или белковой природы (интерферонов, антигенов, анти тел, гормональных препаратов) широко используется биотехнология на основе генетической инженерии (выделение и клонирование генов, получение кДНК, введение генов в чужеродные про- или эукариотические клетки и наработка продукта белковой природы в случае происходящей экспрессии введенных генов — «генов инте реса» в трансформированных клетках). Несмотря на существенные успехи, достигнутые в области генно-инженерной биотехнологии, этот подход имеет и свои ограничения: 1) не все гены экспресси руются в чужом окружении ввиду несоответствия элементов регу ляции реципиентных клеток и донорских генов;

2) экспрессии поли цистронных генов (и соответственно мРНК), пока достигнуть не удалось;

3) не происходит посттрансляционная модификация и формирование структуры многомерных белков высших эукариот в бактериальных клетках.

В качестве альтернативы генно-инженерной биотехнологии полу чения лекарственных белков можно использовать бесклеточные систе мы белкового синтеза, в которых при обеспечении оптимальных условий возможна наработка белков как простых, так и со сложной структурой с устранением всех барьеров несовместимости для транс ляции мРНК, программирующих синтез лекарственного белка. Одна ко, несмотря на то, что этот методический подход был предложен гораздо раньше, чем генно-инженерный, детальные разработки возможностей его широкого практического использования не прово дились.

В настоящей работе мы рассматриваем суть этой проблемы с точки зрения регуляторики и последовательности процессов, с кото рыми может быть сопряжён синтез белка в бесклеточных системах с внесением в них для трансляции не индивидуальных, а суммарных препаратов мРНК, содержащих мРНК не только для синтеза плани руемого белка, но и синтеза всей гаммы белков клеток.

Впервые такие опыты были успешно поставлены ещё в конце 60-х годов прошлого века (краткая информация о них приведена ниже). Целью этой работы является рассмотрение сложной системы регуляции процессов трансляции в бесклеточных системах биосин теза белков, опираясь на современные знания о последовательности механизмов, происходящих в клетках, вовлекаемых в трансляцию каждой из молекул мРНК, присутствующей в суммарной популяции мРНК.

В связи с возрастающим применением физиологически активных соединений в растениеводстве актуально исследование их влияния на генетический аппарат клеток растений. Одним из главных крите риев оценки действия тех или иных соединений на геном клеток, в том числе регуляторов роста, являются изменения экспрессии генов, включающие процессы транскрипции, процессинг РНК, перенос из ядра в цитоплазму «зрелых» транскриптов (в виде мРНК и рРНК) и трансляции мРНК на рибосомах цитоплазмы.

В предыдущей работе [103] было установлено, что под воздей ствием регуляторов роста появляются значительные различия в попу ляциях мРНК, выделенных из клеток контрольных и обработанных регуляторами роста растений. Целью этой работы явилось выяснение вопроса, каким образом эти различия проявляются в программируе мых мРНК процессах биосинтеза белков.

В клетках растений мРНП-частицы [5], перешедшие из ядра в цитоплазму, являются информосомами двух классов: те, что сразу включаются в биосинтез белка с формированием полирибосом из мРНП и рибосом, и те, которые откладываются в запас — запасные или резервные мРНП, которые используются на дальнейших стадиях онтогенеза растений. При переходе информосом в цитоплазму частич но изменяется состав их белков — появляются белки, которые обеспе чивают трансляцию мРНП и исчезают белки, обеспечивающие транс порт мРНП из ядра в цитоплазму.

Таким образом, препарат цитоплазматических поли(А) +мРНК представляет собой полный набор копий генов (за исключением некоторых поли(А)-мРНК, в частности, гистоновых мРНК), которые экспрессируются на том или ином этапе онтогенеза растений. Мето дами молекулярной гибридизации кДНК на определённом этапе онто генеза с мРНК на других стадиях онтогенеза или с мРНК, выделен ных из клеток организмов, которые находились под воздействием тех или иных факторов (например, регуляторов роста), можно определить Биорегуляция роста и развития растений степень гомологии (или отличий) в популяциях мРНК, с которых осуществляется синтез специфических белков.

Ранее нами было показано [103], что под воздействием синтети ческих и природных регуляторов роста появляются значительные отличия в наборе мРНК из клеток опытных растений по сравнению с контролем, которые зависят от природы регулятора роста. Важно знать, каким образом эти отличия будут опосредоваться на конечных продуктах экспрессии генов — белках и уровнях белоксинтезирующей активности разных по своему набору мРНК. Считается, что наиболее целесообразным для решения этих вопросов является использование бесклеточных систем белкового синтеза, с помощью которых можно получить прямые ответы на указанные вопросы благодаря исключе нию других факторов регуляции биосинтеза белка в целостном орга низме.

Задачей данной работы было определение, каким образом обна руженные нами различия между популяциями цитоплазматических мРНК, выделенных из растений, обработанных разными регулятора ми роста, опосредуются на уровне и продолжительности синтеза белка в бесклеточных системах.

Как уже подчёркивалось, бесклеточная система служит для проверки матричной активности или природной мРНК (поли(А)+мРНК) или синтетических полинуклеотидов.

В отделе механизмов трансляции генетической информации Института радиофизики и электроники АН УССР (г. Харьков) груп пой сотрудников во главе с доктором биологических наук профес сором И. Н. Тодоровым ещё в середине 60-х годов прошлого столе тия впервые в мире был синтезирован в гетерологичной бесклеточной системе белкового синтеза (содержащей рибосомы, тРНК и ферменты активации и транспорта аминокислот — аминоацил-тРНК синтетазы из бактериальных клеток;

АТФ-генерирующая система из печени крыс;

препарат мРНК из бычьих аденогипофизов) белок животного происхождения — адре нокортикотропный гормон (АКТГ), состоящий из 39 аминокислот ных остатков. Синтезированный белок по специфическим тестам (стимуляция синтеза кортикостероидов в корковом веществе надпо чечников in vitro;

меланоцитстимулирующая активность — потем нение кожи у зелёных лягушек) показывал высокую биологическую активность [502, 503]. Учитывая, что выделенный из аденогипофи зов суммарный препарат мРНК содержал матрицы и для синтеза многих других белков, интерес представляет изучение всего «спек тра» (набора) белков, синтезированных в бесклеточной системе.

Однако в указанных работах авторами это не было сделано.

Разрабатывались также подходы оптимизации условий синтеза нуклеиновых кислот и белков в бесклеточных системах [504].

В настоящее время используют два типа бесклеточных систем:

из проростков пшеницы;

из ретикулоцитов кролика [916, 1026].

Бесклеточные системы из проростков пшеницы, а также из рети кулоцитов кролика обеспечивают трансляцию in vitro широкого разно образия вирусных, прокариотических и эукариотических мРНК в белки [1026]. Бесклеточные системы содержат компоненты клеток, необходимых для синтеза белка: тРНК, рРНК, рибосомы, ферменты активации и транспорта аминокислот, факторы инициации, элонга ции и терминации трансляции. Система оптимизируется введением компонентов: фосфокреатинкиназы, фосфокреатина и спермидина для усиления эффективности элонгации полипептидных цепей и для предотвращения преждевременной терминации элонгации: ацетат магния в концентрации, рекомендованной для трансляции большин ства видов мРНК [916, 1026]. Для инициации трансляции добавляют экзогенные аминокислоты (включая соответствующую радиоактивно меченную аминокислоту) и мРНК. Ацетат калия применяется для обеспечения пригодности бесклеточной системы для трансляции широкого круга мРНК.

В своих опытах для решения поставленных задач мы использо вали бесклеточную систему из проростков пшеницы с указанными выше модификациями, которые обеспечивают синтез полноразмерных белков.

Суммарная цитоплазматическая мРНК является набором широко го круга матриц как по их размеру, так и по функции, с которых осуществляется синтез большого количества структурных и функ циональных белков, в том числе, рибосомных белков, регуляторных белков (в частности, регуляторов трансляции), пептидов, белков ферментов и др. Ряд авторов [916, 1026] обосновывают необходимость добавления в бесклеточную систему ингибиторов РНКаз для предот вращения возможного разрушения РНК матриц, которые вносятся в систему в случае присутствия в системах эндогенных РНКаз, что приводит к синтезу более высокомолекулярных белков. Другие авто ры считают необязательным добавление в среду ингибиторов РНКаз (например, РНКазина), а вместо этого предлагают 30 мин прединку бацию бесклеточных систем (до внесения мРНК) в присутствии добавленной в систему гетерологичной РНК (например, тРНК) для «истощения» эндогенных матриц и снижения возможной РНКазной активности.

По нашему мнению, внесение в бесклеточную систему гетеро генной популяции мРНК запускает синтез разнообразных белков, в Биорегуляция роста и развития растений том числе и нуклеаз, которые избирательно разрушают структуры тех или иных поли(А)+мРНК по специфическим сайтам (возможно по типу рестриктаз, фрагментирующих ДНК по специфическим сайтам).

Благодаря этому можно определить продолжительность жизни мРНК в бесклеточных системах. В соответствии с имеющимися многочис ленными данными литературы [94, 95, 472, 493, 916, 1006] продол жительность жизни разных типов мРНК in vivo исчисляется несколь кими минутами, часами и даже сутками.

Возможно, существует широкий спектр специфических РНКаз, разрушающих те или иные типы мРНК, детерминируя продолжитель ность их жизни. Эти внутриклеточные механизмы очевидно должны проявляться (может и не в такой строгой скоординированности, как in vivo), в субординации последовательности синтеза и распада РНКаз в зависимости от скорости расщепления матриц. Регуляция продол жительности жизни мРНК может также осуществляться путём синте за, с одной стороны, защитных от РНКаз специфических белков для тех или иных матриц, и с другой стороны, путём соблюдения времен ной скорости синтеза РНКаз, контролирующих разрушение коротко и долгоживущих мРНК. В пользу этого свидетельствуют многочис ленные данные литературы о наличии в клетках высших эукариот суперсемейств генов РНКаз, разрушающих мРНК с помощью разных механизмов действия [775], которые рассматриваются ниже.

Пролонгированное функционирование мРНП при стимулируемом росте (связанное с формированием увеличенных по размеру по срав нению с нормой тканей, органов и в целом тела растения) можно объяснить необходимостью наработки значительно большего количе ства (путём увеличения циклов трансляции) каждого из структурных и функциональных элементов клеток.

Мы использовали классический состав бесклеточных систем из проростков пшеницы [916, 1026]. Синтез белка изучали более длитель ное время, чем это принято в литературе, для определения времени функционирования мРНК. Для этого через 90 мин в пробы добавля ли дополнительно аминокислоты, АТФ и ГТФ.

Естественно, что в бесклеточных системах, как и в клетках in vivo, продолжительность жизни специфических РНКаз должна регу лироваться синтезом специфических протеаз, последовательно расще пляющих молекулы РНКаз после проявления их каталитической активности. Эти процессы осуществляются в определённой согласо ванности во времени параллельно с синтезом защитных белков для долго- и короткосуществующих мРНК, которое определяется разме ром мРНК, нуклеотидной последовательностью, возможной респира лизацией структуры мРНК (вероятно и образованием шпилечно подобных структур) в процессе инкубации в физиологической среде и синтезом соответствующих протеаз. Однако для подтверждения существования такой последовательности рассмотренных биологиче ских процессов необходимо проведение специальных опытов.

На рис. 91 представлены результаты исследований кинетики синтеза белков в бесклеточной системе из проростков пшеницы на матрицах поли(А) + РНК из контрольных растений и растений со стимулируемым разными регуляторами ростом. По интегральным показателям скорости и длительности синтеза суммарных белков наблюдаются существенные отличия. Препараты мРНК, выделенные из растений со стимулированным ростом как синтетическим регуля тором ивином (см. рис. 91, кривая 2), так и регуляторами природ ного происхождения аверкомом, эмистимом С (см. рис. 91, кривые 4, 5), обеспечивают, как и в опытах in vivо [103] более высокий уровень биосинтеза белка по сравнению с контролем (см. рис. 91, кривая 1) в бесклеточных системах in vitro. Препараты мРНК, полу ченные из растений со стимулируемым ростом природными регуля торами (см. рис. 91, кривые 3, 4, 5) обладают относительно высшим потенциалом в стимуляции синтеза белка in vitro, а также более пролонгированной белок-синтезирующей активностью по сравнению с синтетическим препаратом (см. рис. 91, кривая 2).

рис. 91. Кинетика К включения [35S]-метионина в ТХУ-нерастворимый материал в бесклеточной системе из проростков пшеницы с использова нием в качестве матрицы поли(А)+ РНК:

1 — контроль;

2—5 — включение метки в полипептиды в присутствии в среде поли(А)+ РНК из растений, обработанных ивином (2), эмистимом С (5), аверко мом (4);

аверкомом и эмистимом С (3) Биорегуляция роста и развития растений Следует отметить, что препараты поли(А)+РНК из растений, которые обрабатывались аверкомом совместно с эмистимом С (см.

рис. 91, кривая 3), проявляют более низкую белоксинтетическую активность по сравнению с индивидуальными препаратами (см. рис.

91, кривые 4, 5), возможно за счёт конкуренции, которая возникает при связывании с сайтами рибосом, близкими по структуре мРНК из растений, обработанных аверкомом и эмистимом С.

Можно предположить, что указанные отличия в уровнях интен сивности и длительности биосинтеза белка связаны с обнаруженны ми нами ранее [103] отличиями в популяциях мРНК из контрольных растений и растений, обработанных регуляторами роста.

Возможно, что в популяциях мРНК матриц из опытных растений присутствуют мРНК с повышенной функциональной активностью для быстрой наработки определённых ключевых белков при ускоренном росте растений (например, белков рибосом, активаторов трансляции, структурных белков клеточной стенки или ферментов синтеза фито гормонов и др.). Очевидно, что скорость и длительность трансляции молекул мРНК определяется, прежде всего, её структурными особен ностями.

Следует отметить, что добавление в параллельных опытах в пробы ингибитора РНКаз РНКазина приводило к увеличению уровня белко вого синтеза и его длительности, начиная с 30-й мин инкубации (возможно за счёт нарушения указанной выше природной последо вательности распада каждой из молекул мРНК).

На рис. 92 представлены результаты гель-электрофореза с после дующей флюорографией белков, синтезированных в бесклеточной системе из проростков пшеницы. По характеру распределения белков в геле можно отметить, что в бесклеточной системе синтезируется весьма гетерогенный по молекулярной массе набор белков (от высо комолекулярных до низкомолекулярных), причём чётких границ между отдельными фракциями нет, по-видимому за счёт распределе ния белков общими массивами, что приводит к перекрыванию ради оактивных треков с белков, расположенных рядом в геле, и соот ветственно к исчезновению границ между отдельными фракциями.

Это свидетельствует о высокой функциональной активности выде ленных нами препаратов поли(А)+мРНК. Очевидно, что градиент молекулярных масс белков является отражением многообразия моле кулярных масс функционально активных мРНК.

Чтобы установить, происходит ли синтез протеолитических белков (ферментов) наряду со структурными белками, в наших опытах в бесклеточную систему вносили ингибитор протеаз трип синового типа — фенилметилсульфонилфторид. Гель-фильтрация рис. 92. Флюорографический имеющиеся литературные данные о анализ электрофоретического процессах реализации генетической «спектра» полипептидов, синте- информации (закодированной в зированных с помощью поли(А) + ДНК) на уровне трансляции.

РНК в бесклеточной системе из проростков пшеницы:

а — поли(А) РНК из клеток заро- н у к л е о п р о т е и д н ы й комплекс.

дышевых осей фасоли при обработ- В течение своего существования ке эмистимом С;

б — аверкомом;

мРНК эукариот ассоциируется с в — включение метки в синтезиро- разнообразными факторами иници ванные полипептиды без добавле ния в среду поли(А) + РНК (конт- ации трансляции, некоторые из роль) ся в динамическом состоянии. Эти данные приведены в обзорах [946, 1181]. мРНК в комплексе с дифференцированными по функ циям белками и разными классами малых некодирующих микроРНК (miRNA), малыми интерферирующими РНК (siRNA), ассоциирован ными с повторяющимися последовательностями — малыми интер ферирующими РНК (rasiRNA) образуют месcенджер-рибонуклеиновые частицы (мРНП) [500, 501]. Малые РНК (длиной 21—30 нуклеоти дов) принимают участие на всех уровнях реализации генетической программы у эукариот. Для процессинга двуцепочечных РНК (dsRNA) необходимы малые РНК и особые классы белков: специ Биорегуляция роста и развития растений фичные для dsRNA эндонуклеазы, в частности DICER эндонуклеа за [1181], dsRNA-связывающие белки, называемые Argonaute белка ми [789, 1094, 1110]. Argonaute белки содержат два РНК-связывающих домена: Piwi-домен, к которому присоединяются малые РНК своим 5’ концом, и PAZ-домен, связывающий одноцепочечный 3’ конец малых РНК [1181]. Эндонуклеаза, расщепляющая молекулы-мишени РНК, располагается на Piwi-домене, и этот домен является гомоло гичным домену, присутствующему у эндонуклеазы РНК - РНКазы Н [1094, 1181].

Малые РНК совместно с ассоциированными с ними белками действуют различными «РНК-молчащими» путями, регулируя транс крипцию, структуру хроматина, целостность генома, мРНК стабиль ность, процесс трансляции. РНК могут быть небольшими, но для их образования, созревания и регуляторной функции требуется актив ность большого числа белков.

Эти белки содержат РНК-связывающий домен, РНК-определяющий мотив (RRM);

другие обычно распространённые РНК-связывающие мотивы включают КН-домен, суперспирализованный РНК-связывающий домен (dsRBD), zinc-finger домены, RGG-бокс и Pumilio-гомологичные домены, которые обнаружены в PUF-белках — семействе цитоплазма тических мРНП-белков, которые контролируют трансляцию и стабиль ность мРНК через связывающие сайты в 3`-нетрансляционных регио нах (UTRs) [762, 946, 1103]. мРНП-компоненты имеют элементы, найденные в практически каждой мРНК эукариот: 7-метилгуанозиновый кеп или ядерный 5’ кеп-связывающий комплекс (СВС 20/80), или большое количество кеп аналогов, присутствующих на 5’ конце всех РНК-полимеразных транскриптов, а также поли (А)+-последовательности на 3'-концах мРНК [734, 874, 915].

К числу наиболее распространённых последовательностей в 3’ нетрансляционных регионах (UTRs) мРНК относятся аденилат/ уридилат-обогащенные элементы (AREs), детерминирующие стабиль ность мРНК и кодирующие прото-онкогены, ядерные транскрипци онные факторы и цитокины [667]. На AREs-направленную деградацию мРНК оказывают влияние многие экзогенные факторы, включая форбольные эфиры, ионофоры кальция, цитокины и ингибиторы транскрипции. Таким образом, AREs играют выдающуюся роль в регуляции экспрессии генов на стадиях деления и дифференциации клеток, а также принимают участие в иммунном ответе.

Существуют также другой распространённый класс Y-бокс белков и экзон-объединяющий комплекс (EJC), которые распространены на протяжении всей цепи транскриптов независимо от последователь ностей нуклеотидов [1089, 1112].



Pages:     | 1 |   ...   | 8 | 9 || 11 | 12 |   ...   | 17 |
 




Похожие материалы:

«Отдел по церковной благотворительности и социальному служению Русской Православной Церкви Региональная общественная организация поддержки социальной деятельности Русской Православной Церкви Милосердие Е.Б. Савостьянова Как организовать помощь кризисным семьям в сельской местности Опыт Курской областной организации Центр Милосердие Лепта Книга Москва 2013 1 УДК 364.652:314.6(1-22) ББК 60.991 С13 Серия Азбука милосердия: методические и справочные пособия Редакционная коллегия: епископ ...»

«Орловская областная публичная библиотека им. И. А. Бунина БИБЛИОТЕЧНО- ИНФОРМАЦИОННОЕ ПОЛЕ АГРАРИЕВ Орел 2010 ББК 78.386 Б 59 Библиотечно-информационное поле аграриев : методико-информацион- ный сборник / Орловская обл. публ. б-ка им. И. А. Бунина ; [сост. Е. А. Су- хотина]. – Орел : Издатель Александр Воробьёв, 2010. – 108 с. В настоящее время наблюдается резкое увеличение интереса специалистов агро промышленного комплекса к проблемам использования возможностей информационно коммуникационных ...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования КРАСНОЯРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПЕДАГОГИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ им. В.П. Астафьева ПОЛЕВАЯ БОТАНИКА МОРФОЛОГИЯ И СИСТЕМАТИКА ЦВЕТКОВЫХ РАСТЕНИЙ. ОСНОВЫ ФИТОЦЕНОЛОГИИ Учебное пособие Электронное издание КРАСНОЯРСК 2013 ББК 28.5я73 УДК 58 П 691 Составитель: Н.Н. Тупицына, доктор биологических наук, профессор Рецензенты: А.Н. Васильев, доктор ...»

«Департамент культуры города Москвы Государственный Дарвиновский музей КАТАЛОГ КОЛЛЕКЦИИ РЕДКАЯ КНИГА БОТАНИКА Москва 2013 ББК 79л6 К 95 Государственный Дарвиновский музей Составители: заведующая сектором Редкая книга В. В. Миронова, старший научный сотрудник Э. В. Павловская, заведующая справочно-библиографическим отделом О. П. Ваньшина Фотограф П. А. Богомазов Редакторы: Н. И. Трегуб, Т. С. Кабанова Каталог коллекции Редкая книга. Ботаника / cост. В. В. Миронова, Э. В. Павловская, О. П. ...»

«С.-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ В. С. ИПАТОВ, Л. А. КИРИКОВА ФИТОЦЕНОЛОГИЯ Рекомендовано Министерством общего и профессионального образования Российской Федерации в качестве учебника для студентов высших учебных заведений, обучающихся по направлению и специальности Биология САНКТ-ПЕТЕРБУРГ ИЗДАТЕЛЬСТВО С.-ПЕТЕРБУРГСКОГО УНИВЕРСИТЕТА 19 9 7 УДК 633.2/3 И76 Рецензенты: д-р биол. наук В. И. Василевич (БИН РАН), кафедра бо таники и экологии растений Воронежского университета (зав. ...»

«Петра Ньюмейер – Натуральные антибиотики ЗАЩИТА ОРГАНИЗМА БЕЗ ПОБОЧНЫХ ЭФФЕКТОВ МИР КНИГИ ББК 53.52 Н92 Petra Neumayer NATRLICHE ANTIBIOTIKA Ньюмейер, Петра Н 92 Натуральные антибиотики. Защита организма без побочных эффектов. / Пер. с нем. Ю. Ю. Зленко — М.: ООО ТД Издательство Мир книги, 2008. — 160 с. Данная книга является уникальным справочником по фитотерапии. Автор простым и доступным языком излагает историю открытия натуральных антибиотиков, приводит интересные факты, повествующие об их ...»

«Министерство сельского хозяйства Российской Федерации ФГБОУ ВПО Вологодская государственная молочнохозяйственная академия имени Н.В. Верещагина Первая ступень в науке 2 часть Сборник трудов ВГМХА по результатам работы II Ежегодной научно-практической студенческой конференции Экономический факультет Вологда – Молочное 2013 ББК: 65.9 (2Рос – в Вол) П 266 Редакционная коллегия: к.э.н., доцент Медведева Н.А.; к.э.н., доцент Юренева Т.Г.; к.э.н., доцент Иванова М.И.; к.э.н., доцент Бовыкина М.Г.; ...»

«И.П. Айдаров, А.И. Корольков ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ КОМПЛЕКСНЫХ МЕЛИОРАЦИЙ В РОССИИ МОСКВА, 2003 1 УДК В книге на основании обобщения результатов многолетних опытно-производственных и теоретических исследований и имеющегося опыта рассмотрены проблемы природопользования в сфере АПК и особенности природно-хозяйственных условий экономических районов. Дан анализ изменения основных свойств природных ландшафтов при трансформации их в агроландшафты. Выявлены причинно-следственные связи, на основании ...»

«Управление по охране окружающей среды Пермской области Пермский государственный университет Пермский государственный педагогический университет Жемчужины Прикамья (По страницам Красной книги Пермской области) Пермь 2003 УДК 574 ББК 28.088 Ж53 ЖЕМЧУЖИНЫ ПРИКАМЬЯ (По страницам Красной книги Пермской области) Издание предназначено для школьников, изучающих биологию и эко- логию в средних школах и лицеях по всем действующим программам, в ка честве регионального материала, а также в учреждениях ...»

«Министерство сельского хозяйства Российской Федерации Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Пермская государственная сельскохозяйственная академия имени академика Д.Н. Прянишникова ИННОВАЦИОННОМУ РАЗВИТИЮ АПК – НАУЧНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ Сборник научных статей Международной научно-практической конференции, посвященной 80-летию Пермской государственной сельскохозяйственной академии имени академика Д.Н. Прянишникова (Пермь 18 ноября 2010 года) Часть ...»

«МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РЕСПУБЛИКИ БАШКОРТОСТАН Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования БАШКИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ООО БАШКИРСКАЯ ВЫСТАВОЧНАЯ КОМПАНИЯ НАУЧНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ УСТОЙЧИВОГО ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ И РАЗВИТИЯ АПК Часть III НАУЧНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ УСТОЙЧИВОГО РАЗВИТИЯ ЖИВОТНОВОДСТВА И ПЧЕЛОВОДСТВА ВЕТЕРИНАРНАЯ НАУКА – ПРОИЗВОДСТВУ Материалы всероссийской ...»

«Министерство сельского хозяйства РФ Департамент научно-технологической политики и образования Министерство сельского хозяйства Иркутской области Иркутская государственная сельскохозяйственная академия Аграрный университет, Краков, Польша Монгольский государственный сельскохозяйственный университет Белорусская государственная сельскохозяйственная академия Казахский национальный аграрный университет ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ БЕЗОПАСНОСТЬ И ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ АГРАРНОГО ПРОИЗВОДСТВА ЕВРАЗИИ Материалы ...»

«МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ АЛТАЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ Е.Г. Парамонов, А.А. Маленко ОСНОВЫ ЛЕСОВОДСТВА И ЛЕСОПАРКОВОГО ХОЗЯЙСТВА Учебное пособие Барнаул Издательство АГАУ 2007 УДК 634.0.2.(635.91) Парамонов Е.Г. Основы лесоводства и лесопаркового хо зяйства: учебное пособие / Е.Г. Парамонов, А.А. Маленко. Бар наул: Изд-во АГАУ, 2007. 170 с. Учебное издание ...»

«МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ АЛТАЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ Е.Г. Парамонов, А.П. Симоненко ОСНОВЫ АГРОЛЕСОМЕЛИОРАЦИИ Учебное пособие Барнаул Издательство АГАУ 2007 УДК 634.0.2.(635.91) Основы агролесомелиорации: учебное пособие / Е.Г. Пара монов, А.П. Симоненко. Барнаул: Изд-во АГАУ, 2007. 224 с. В учебном издании приведены основные положения, рас крывающие ...»

«издательство ВАЛЕНТИН Владивосток Издательство Валентин 2012 УДК 94(571.6) ББК 63.3 П13 Пак В. П13 Земля вольной надежды. Книга 1. Очерки дореволюци- онной истории Надеждинского района / В. Пак. – Вла- дивосток: Валентин; 2011. – 216с. ISBN 978-5-9901711-5-2 Земля Вольной Надежды раскрывает страницы истории На- деждинского района. Повествование охватывает в основном период с середины ХIХ века по 1917 год, когда шло заселение далёкой окраи ны, развивающей российскую государственность с момента ...»

«5 Turczaninowia 2002, 5(3) : 5–114 СИСТЕМАТИЧЕСКИЕ ОБЗРОРЫ УДК 582.683.2(47) В.И. Дорофеев V. Dorofeyev КРЕСТОЦВЕТНЫЕ (CRUCIFERAE JUSS.) ЕВРОПЕЙСКОЙ РОССИИ CRUCIFERAE OF EUROPEAN RUSSIA Предлагаемый Вашему вниманию список сем. Cruciferae Европейской России является второй большой попыткой познакомить читателей Turczaninowia с представителями европейских крестоцветных. Первая работа, опубликованная в 3 выпуске за 1998 год, касалась крестоцветных Средней полосы европейской части Российской ...»

«ЧТЕНИЯ ПАМЯТИ АЛЕКСЕЯ ИВАНОВИЧА КУРЕНЦОВА A. I. Kurentsov's Annual Memorial Meetings _ 2011 вып. XXII УДК 595.7.001 А.И. КУРЕЦОВ: ДНЕВНИК ОБ ЭКСПЕДИЦИИ В УССУРИЙСКИЙ КРАЙ В 1928 ГОДУ Ю.А Чистяков Биолого-почвенный институт ДВО РАН, г. Владивосток Приведены дневниковые записи А.И. Куренцова за время его шестимесячной экспедиции в Уссурийский край в 1928 г. Записи содержат данные о растениях и растительности, насекомых, птицах и других животных, встреченных А.И. Куренцовым во время экскурсий, ...»

«МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ АЛТАЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ Н.Д. ОВЧАРЕНКО, О.Г. ГРИБАНОВА БИОЛОГИЯ ЖИВОТНЫХ УЧЕБНОЕ ПОСОБИЕ Барнаул Издательство АГАУ 2012 УДК 574. (072) Рецензенты: д.б.н., профессор, зав. кафедрой экологии Алтайского государст венного университета Г.Г. Соколова; к.б.н., доцент кафедры генетики и разведения сельскохозяйствен ных ...»

«1 Основы идеологии белорусского государства Под общей редакцией профессора С.Н. Князева и профессора С.В. Решетникова МИНСК 2004 2 УДК ББК И Авторский коллектив: кандидат юридических наук, профессор Князев С.Н., доктор политических наук, профессор Решетников С.В., доктор юридических наук, профессор Василевич Г.А., доктор политических наук, профессор Земляков Л.Е., кандидат философских наук, доцент Денисюк Н.П., кандидат политических наук, доцент Антанович Н.А., доктор философских наук, ...»






 
© 2013 www.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.