WWW.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 ||

«Министерство образования Республики Беларусь УЧРЕЖДЕНИЕ ОБРАЗОВАНИЯ «ГРОДНЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ ЯНКИ КУПАЛЫ» В.И. ...»

-- [ Страница 4 ] --

Перспективно использование растений в качестве «биореакторов» для синтеза каких-либо белков или других веществ, поскольку они (растения) быстро растут, и их выращивание не требует высококвалифицированного труда. В настоящее время получены трансгенные растения, синтезирующие чужеродные белки, использование которых возможно в различных областях народного хозяйства.

Удалось достичь продукции в растениях человеческого -интерферона. С помощью растений можно получать бактериальные антигены и использовать их в качестве вакцин. Создан трансгенный картофель, продуцирующий субъединицу -токсина холеры, которую возможно использовать в качестве вакцины от холеры. В растениях получена продукция антител, специфичных для Strepto coccus mutans – бактерий, вызывающих зубной кариес. Не исключено их использование в зубных пастах.

В геном растений Arabidopsis thaliana и Brassica napus был встроен химерный ген, состоящего из части гена запасного белка арабидопсиса и кодирующей части гена нейропепти да – энкефалина. В белковом продукте этого химерного гена два структурных домена были связаны последовательностью, узнаваемой трипсином. Действием этого протеолитического фермента на гибридный белок можно из него вычленить энкефалин.

Российские ученые создали трансгенную морковь, способную стимулировать иммунитет. Морковь продуци рует иммуномодулирующие белки человека интерлейкины.

Глава 8. ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ ЖИВОТНЫХ Генная инженерия животных позволяет преодолеть межвидовые барьеры. С помощью ДНК технологий можно животным переносить гены не только других видов животных, но и гены растений и прокариот. Если чужеродный ген интегрирован в геном животного, то такой ген называется трансгеном, а животное, содержащее в геноме трансген, – трансгенным. Белок, кодируемый трансгеном, носит название трансгенный белок.

Трансгенных животных создают с целью:

• изучения функций генов и особенностей их экс прессии;

• получения животных с улучшенными харак теристиками;

• получения моделей для изучения генетических забо леваний и разработки способа их лечения;

•получения трансгенных белков.

При получении трансгенных животных для переноса генов в их геном используют следующие подходы:

•микроиньекция чужеродной ДНК в пронуклеус зиготы;

• введение чужеродной ДНК с помощью ретровирус ных векторов в клетки эмбриона на его ранних стадиях развития перед имплантацией в самку-реципиента;

• введение генетически модифицированных эмбрио нальных стволовых клеток (ЭСК) в эмбрион на его ранних стадиях развития перед имплантацией в самку-реципиента.

Рассмотрим последовательность действий при созда нии трансгенных животных с использованием метода микроиньекции ДНК в пронуклеус зиготы (рис. 8.1). В начале из яйцевода самки извлекают зиготы. Затем под объективом микроскопа в микронуклеус зиготы с помощью микропипетки вводится генетическая конструкция, содер жащая чужеродный ген. Мужской пронуклеус значи тельно крупнее женского, поэтому в него легче ввести препарат ДНК. В качестве генетической конструкции для доставки генов может использоваться плазмидный вектор, содержащий трансген и промотор, способный обеспечивать экспрессию чужеродного гена в клетках млекопитающих. В пронуклеус вводится до 100 и более копий гена. На следую щем этапе зиготу трансплантируют ложнобеременной самке другой генетической линии. В случае нормального течения беременности суррогатные матери рождают дете нышей, развившихся из реконструированных зигот. Для подтверждения интеграции чужеродного гена в геном новорожденных животных, из них извлекают биологические образцы для ДНК-диагностики на наличие трансгена в их геноме. При использовании рассмотренного подхода, выход трансгенных животных, как правило, не превышает 5 % от исходного числа зигот. При этом не у всех животных трансгены экспрессируются с образованием функционально активного продукта. На заключительном этапе трансген ные животные с экспрессирующимся чужеродным геном используются для получения трансгенного потомства.

Рис. 8.1. Схема получения трансгенных животных методом микроинъекций Метод введения чужеродной ДНК с помощью рет ровирусных векторов в клетки эмбриона характеризуется высокой эффективностью. Однако размер встраиваемой чужеродной ДНК ограничен и составляет до 8 т.п.н. При использовании этого метода последовательность этапов получения трансгенных животных следующая. Эмбрион, как правило, на стадии 8 клеток инфицируют рекомбинантным ретровирусом, содержащим трансген. Ретровирусный вектор способен не только доставить чужеродные ген во все клетки эмбриона, но и обеспечить его встраивание в ДНК. После инфицирования эмбрион имплантируют суррогатной мате ри. При удачном стечении обстоятельств плод развивается и рождается трансгенное животное, которое затем используют для получения трансгенного потомства (рис. 8.2).

Рис. 8.2. Схема получения трансгенных животных с использованием метода введения чужеродной ДНК с помощью ретровирусных векторов в клетки Метод получения трансгенных животных с ис пользованием ЭСК нашел широкое применение.

ЭСК являются полипотентными, так как могут диф ференцироваться в клетки всех зародышевых листков. Если их (ЭСК) ввести в полость бластоцисты, то они могут дать начало любым органам и тканям химерных животных. ЭСК получены из различных животных: из мышей, золотистого хомячка, свиньи, овцы, коровы, обезьяны, человека и др.

Рассмотрим этапы получения трансгенных животных с использованием ЭСК (рис. 8.3):

• получение ЭСК;

• введение в ЭСК генетической конструкции, содер жащей трансген. Трансформацию ЭСК осуществляют с помощью электропорации или микроинъекций ДНК в ядро клетки;

• получение от животных-доноров бластоцист для микроинъекции в них трансформированных ЭСК;

• конструирование химерных эмбрионов, посредством микроинъекции трансформированных ЭСК в полость бластоцист;

• имплантация химерных эмбрионов суррогатной матери;

• получение химерного потомства от суррогатной матери;

• генетический анализ родившихся животных на наличие в их геноме трансгена, выявление трансгенных животных, в ДНК половых клеток которых присутствует трансген;

•получение гомозиготных трансгенных потомков в результате скрещивания химерных животных, в половых клетках которых выявлен трансген.

Рис. 8.3. Схема получения трансгенных животных с использованием ЭСК ЭСК можно направлено модифицировать с помощью методов генной инженерии. Созданы векторы, которые способны обеспечивать встраивание трансгена в строго определенные участки генома (сайты-мишени) ЭСК. Такие сайт-мишени находятся в участке ДНК, которые не кодируют белков, необходимых для жизнеобеспечения ЭСК. В связи с этим встраивание трансгена в эти области не влияет на функционирование ЭСК. В состав таких векторов входят:

•трансген;

• два блока нуклеотидных последовательностей (НВ и НВ2), гомологичных участкам сайта-мишени. Эти блоки обеспечивают интеграцию трансгена в хромосому, за счет гомологичной рекомбинации;

• ген Neor, обуславливающий устойчивость к соеди нению G-418;

•два разных гена тимидинкиназы вируса простого герпеса типов 1 и 2 HSV-tk1 и HSV-tk2. Тимидинкиназа способна катализировать превращение ганцикловира в токсический для ЭСК продукт. Следовательно, добавление ганцикловира в культуру клеток, в которой синтезируется тимидинкиназа, приведет к гибели клеток.

Трансген и ген Neor расположены между блоками НВ и НВ2, а гены HSV-tk1 и HSV-tk2 по обеим сторонам этой конструкции (рис. 8.4).

Рис. 8.4. Схема интеграции трансгена в геном ЭСК. А – интеграция посредством гомологичной рекомбинации фрагмента вектора непосредственно в сайт мишень, Б – неспецифическая интеграция вектора в хромосому. ТГ – трансген После попадания вектора в ядро ЭСК возможна интеграция посредством гомологичной рекомбинации (рис. 8.4А) фрагмента вектора, расположенного между НВ и НВ2 и содержащего трансген и ген Neor, непосредственно в сайт-мишень. В этом случае гены HSV-tk1 и HSV-tk не будут интегрированы в хромосому. Возможна также и неспецифическая интеграция вектора в хромосому, приводящая к встраиванию в нее трансгена, гена Neor и генов тимидинкиназы (рис. 8.4Б). Следует отметить, что в некоторых ЭСК векторная ДНК вообще не интегрирует в хромосому. Следовательно, в их геноме будут отсутствовать и трансген, и гены Neor, HSV-tk1, HSV-tk2. С помощью G- и ганцикловира можно отобрать ЭСК, в которых произошла интеграция трансгена в сайт-мишень за счет гомологичной рекомбинации. Такие клетки растут в присутствии обоих этих веществ. Ген Neor обеспечивает их устойчивость к G-418, а отсутствие генов тимидинкиназы определяет устойчивость к ганцикловиру, поскольку последний в от сутствии тимидинкиназы не превращается в токсическое вещество. В то же время ЭСК со встроенным вектором за счет неспецифической интеграции при выращивании в среде с G-418 и ганцикловиром погибнут, поскольку в них при сутствует ген тимидинкиназы и, соответственно, синтезирует ся тимидинкиназа, превращающая субстрат (ганцикловир) в токсическое соединение. ЭСК, не приобретшие ген Neor, погибнут при выращивании в присутствии G-418 из-за отсутствия устойчивости к этому веществу. Используя рассмотренный подход, можно получить ЭСК с сайт специфической вставкой.

В качестве сайта-мишени может выступать и функционально активный ген. И тогда встраивание в него какой-либо нуклеотидной последовательности приведет к его инактивации. Таким образом, можно направленно осуществлять подавление («нокаут») гена. Используя такой прием, можно изучать функции тех или иных генов.

Созданы сотни линий мышей с «нокаутированными» генами, используемые в качестве моделей для изучения генетиче ских болезней человека.

Перспективы использования Несмотря на то, что трансгенные животные не имеют столь широкого практического применения как трансгенные растения, перспективы их использования многообразны.

Трансгенные животные – биореакторы В качестве лекарственных препаратов в медицине широко используются белки человека. Эти белки могут быть получены из тканей человека. Очевидно, что при таком способе их получения возникают проблемы. Можно также получать белки с помощью генетически модифицированных бактерий. Однако часто такие белки не идентичны белкам, синтезируемым в клетках человека. Эти отличия могут определяться тем, что в клетках прокариот отсутствуют системы, обеспечивающие посттрансляционные моди фикации белков. Кроме того выделение и очистка белков, синтезированных в бактериальных клетках, является трудо емкой и дорогостоящей процедурой.

С помощью методов генной инженерии можно соз давать трансгенных животных, синтезирующих белки человека. Более того можно добиться выделения чужеродных белков с молоком животных. Это обстоятельство позволяет значительно упростить их получение. Для обеспечения экспрессии трансгена в молочной железе и выделение белка с молоком перед трансгеном следует поместить промотор гена одного из белков, секретируемых с молоком (например, промотор гена казеина).

чужеродных белков создание трансгенных коз или коров, поскольку они дают достаточно много молока. Так, корова может ежегодно продуцировать до 10 000 и более литров молока. В течение одного года от одной коровы можно получить несколько десятков килограмм рекомбинантного белка. В настоящее время получены трансгенные животные, синтезирующие белки человека: антитрипсин, интерферон, фактор свертываемости крови IX, сывороточный аль-бумин, трофобластин, интерлейкин-2, некоторые иммуноглобули ны, тканевой активатор плазминогена, урокиназа и многие другие.

Использование всего нескольких трансгенных коров позволит решить проблему получения некоторых белков человека. Так, заболевание гемофилия связано с нарушением синтеза некоторых факторов свертываемости крови. Мировая потребность в факторе свертываемости крови VIII в год составляет около 7 кг. Эту потребность может обеспечить одна трансгенная корова. Годовая потребность в факторе свертываемости крови IX составляет около 85 кг. Для ее удовлетворения достаточно нескольких коров. Потребность в фибриногене (около 3 т в год) может обеспечить несколько сот трансгенных коров.

Созданы трансгенные коровы, в молоке которых образуется человеческий белок лактоферрин. Этот белок обладает антивирусной, антибактериальной, анти паразитарной, различными каталитическими активностями, радиопротективными свойствами и противораковым, ан тиаллергическим, иммуномодулирующим действиями.

Перспективно использование лактоферрина для про филактики гастроэнтерологических заболеваний у людей с низкой иммунорезистентностью: больных СПИДом, недоношенных младенцев, больных, прошедших радио терапию.

С помощью трансгенных коров можно получать содержащийся в молоке человеческий альбумин. Альбумин используется в медицине для поддержания осмотического давления крови.

с улучшенными характеристиками Непереносимость молока у некоторых людей связана с нарушением синтеза фермента лактазы, расщепляющего молочный сахар лактозу на моносахариды глюкозу и галактозу. У таких людей после приема молока наблюдается желудочное расстройство, сопровождающееся неприятными последствиями. У них поступающая с молоком лактоза не расщепляется, поскольку отсутствует гидролизующий ее фермент лактаза. В связи с этим микроорганизмы кишечника начинают ее использовать в качестве источника энергии и бурно расти, что сопровождается соответствующими симптомами. Если же в геном коровы ввести ген лактазы и заставить его экспрессироваться в молочной железе, то присутствующая в молоке лактоза будет расщеплена до глюкозы и галактозы. Такое молоко без всяких последствий смогут употреблять люди, у которых нарушен синтез лактазы.

Перспективно создание трансгенных коров, про дуцирующих молоко, по своему составу приближенное к молоку человека. С этой целью необходимо выключить некоторые гены коров и ввести несколько генов человека.

В составе человеческого грудного молока содержится антибактериальный фермент лизоцим, в то время как в молоке животных его содержание значительно ниже. Так, в молоке козы лизоцима приблизительно в 3 тысячи раз меньше, чем в человеческом грудном молоке. Посредством введения гена лизоцима получены трансгенные козы, продуцирующие молоко, содержание лизоцима в котором близко к таковому в грудном человеческом молоке.

Сыр является важнейшим продуктом питания.

Его получают из молока. Количество получаемого сыра пропорционально содержанию казеина в молоке.

Содержание казеина в молоке можно увеличить, увеличив число копий гена этого белка, и тем самым усилив его биосинтез.

В начале 80-х годов ХХ века Р.Д.Пальмитером и сотрудниками были получены трансгенные мыши, в геном которых был введен ген гормона роста крысы с металлотиониновым промотором. Последний является регулируемым промотором и обеспечивает экспрессию генов при повышенной концентрации тяжелых металлов.

Трансгенным мышатам давали корм с высоким содер жанием цинка. В результате экспрессия гена гормона роста резко возрастала и, соответственно, возрастала концентрация гормона роста в крови. В связи с этим трансгенные мышата росли значительно быстрее, чем контрольные, у которых повышенная экспрессия гормона роста отсутствовала.

После этих экспериментов были созданы трансгенные сельскохозяйственные животные с повышенной продукцией гормона роста. Однако они были обычных размеров, у некоторых из них наблюдались нарушения в росте, строении костей. Отсутствие увеличения размера у них очевидно связано с тем, что потенциал их роста выбран многовековой селекцией. В то же время были созданы быстрорастущие трансгенные лососи.

Получена трансгенная мышь, способная выполнять повышенные физические нагрузки. Ей был введен ген PGC1B (peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1 beta), кодирующий белок (PGC1-beta). Этот белок активирует транскрипционные факторы, отвечающие за регуляцию жирового и углеводного обменов и состав мышечных волокон. Увеличение экспрессии гена PGC1B повлияло на физические возможности мышей. Трансгенные мыши способны пробегать более длинные дистанции и с более высокой скоростью, чем контрольные мыши.

Выведены трансгенные комары, невосприимчивые жизнеспособными, чем обычные насекомые. Поэтому трансгенные комары могут постепенно вытеснить обычных комаров и помочь в борьбе с малярией. Кроме того комарам введен ген, придающий зеленый блеск глазам. Так можно отличить трансгенных комаров от нетрансгенных.

В мире существует дефицит органов для пересадки их человеку. Перспективно создание трансгенных животных, являющихся донорами органов. Наиболее близки человеку по размеру, строению, биохимическим показателям органы свиньи. Очевидно, что пересаженные органы от обычной свиньи будут эффективно отторгаться иммунной системой человека, произойдет быстрая потеря органа. В связи с этим необходимо сконструировать трансгенную свинью, органы которой не отторгались бы иммунной системой человека.

Недостаток аминокислот цистеина и метионина в организме овцы задерживает рост шерсти. В связи с этим введение в геном овцы дополнительных генов ферментов, ответственных за синтез указанных аминокислот, возможно, повысит качество шерсти.

Созданы трансгенные животные, которые светятся в темноте. Свиньям и цыплятам был введен ген медузы, продукт которого и определял их способность светиться в темноте.

Существуют породы сельскохозяйственных жи вотных, устойчивых к определенным заболеваниям.

Идентификация генов, определяющих такую устойчивость, а затем их использование в качестве трансгенов при создании генетически модифицированных животных позволит получить линии животных, не восприимчивые к заболеваниям. Такой подход окажется приемлемым только в том случае, когда устойчивость определяется одним или небольшим числом генов.

Другой подход, позволяющий получить устойчивых к заболеваниям животных, заключается в интеграции в их геном генов иммуноглобулинов, специфичных к тем или иным возбудителям инфекционных заболеваний.

Экспрессия этих генов защитит животных от болезнетворных микроорганизмов.

К защитным белкам относятся интерфероны, они защищают организм от вирусных заболеваний. В связи с этим можно ожидать, что трансгенные животные с геном интерферона будут менее подвержены вирусным инфекциям, чем нетрансгенные.

Еще одно направление, которое может повысить устойчивость животных к вирусным заболеваниям, заключается во введении в их геном генов, кодирующих антисмысловую РНК. Синтез последних приведет к блокированию иРНК возбудителя заболевания и, соответственно, понизит их жизнеспособность.

С целью изучения течения генетических болезней и разработки способов их лечения целесообразно создание животных, представляющих собой модели генетических заболеваний. Генетические болезни бывают моногенными и полигенными. Очевидно, что в настоящее время о создании трансгенных животных, моделирующих полигенные на следственные болезни, говорить еще преждевременно.

Могут быть созданы два типа трансгенных животных, моделирующих моногенные генетические болезни:

• животные с функционирующим «больным» транс геном (животным вводится человеческий ген, ответственный за заболевание);

• животные, у которых выключен ген, аналогичный тому, который вызывает данное заболевание у человека.

Созданы модели многих наследственных болезней человека, а именно: болезнь Альцгеймера, мышечная дистрофия, нейродегенеративные нарушения, сердечно сосудистые заболевания и др. Несмотря на то, что резуль таты, полученные на модельных животных, нельзя однозначно экстраполировать на человека, тем не менее, полученные знания позволят выявить фундаментальные причины развития болезни и разработать подходы к их лечению.

К настоящему времени выявлены тысячи наследствен ных заболеваний. Для многих из них идентифицированы гены, определяющие данное заболевание. Разработаны методы их диагностики. Приблизительно каждый двадца тый ребенок рождается с наследственным заболеванием.

При этом каждый сотый ребенок получает в наследство серьезный генетический дефект. Несмотря на то, что о наследственных заболеваниях известно много, достаточно эффективных методов их лечения с помощью традиционных методов медицины не найдено. Проблему таких заболева ний можно решить с помощью генотерапии.

Под генотерапией понимают совокупность генно инженерных подходов, обеспечивающих внесение изменений в генетический аппарат соматических клеток человека с целью лечения заболеваний. Задачами генотерапии являются исправление дефектов в структуре ДНК или придания клеткам новых характеристик.

В современных условиях с помощью генотерапии удалось достигнуть успеха только при лечении моногенных наследственных заболеваний. Лечение же полигенных заболеваний и заболеваний, возникших в результате хромосомных аберраций (изменение числа и структуры хромосом), станет возможным при дальнейшем развитии науки.

Лечебный эффект при лечении моногенных нас ледственных заболеваний может быть достигнут за счет следующих подходов:

•введения неповрежденной копии гена;

• подавления экспрессии или разрушения дефектного гена;

• замены дефектного гена неповрежденным. Этого можно достичь в результате гомологичной рекомбинации «лечебного» и «больного» генов, с помощью которой пов режденный ген будет заменен на нормальный;

• введения несвойственных организму генов, обус лавливающих лечебный эффект. Так можно будет ле чить онкологические, инфекционные, аутоиммунные заболевания.

В современных условиях реализован в основном только первый подход: лечение наследственного заболевания посредством введения в клетки неповрежденной копии гена. Для достижения лечебного эффекта с помощью такого подхода нужно:

• идентифицировать ген, ответственный за забо левание;

• создать генетическую конструкцию, содержащую неповрежденный ген и участки ДНК, обеспечивающие его экспрессию;

• разработать методы введения генетической конструкции в клетки больного.

Очевидно, прежде чем приступить к разработке метода лечения наследственного заболевания посредством генотерапии, необходимо идентифицировать ген, с нару шением организации которого связана патология. Для многих наиболее распространенных заболеваний такие гены уже установлены (таблица 9.1).

Наследственные заболевания и гены, нарушение в организации которых приводит к патологии Болезнь Гоше Ген глюкоцереб- Накопление глюкоцереброзидов Эмфизема Ген a1-антитрипсина Дефицит ингибитора сыворо Фенилкетонурия Ген фенилаланингид- Нарушение метаболизма Несиндромальная Ген коннексина 26 Врожденная и ранняя детская тугоухость Нейрофибро- Ген нейрофибро матоз 1-го типа мина (NF1) Мышечная (DMD). Этот белок прогрессирующей мышечной дистрофия стабилизирует атрофией, приводя к полной Гемофилия А свертываемости Нарушение свертываемости крови Гемофилии Б свертываемости Нарушение свертываемости крови иммунодефицит Семейная гипер- липротеина низкой холестерина в крови.

холестеролемия плотности Ишемическая болезнь сердца На основании сведений об организации генов, оп ределяющих наследственное заболевание, необходимо создать генетическую конструкцию, в состав которой входят неповрежденный ген и нуклеотидные последовательности, обеспечивающие его экспрессию в клетках человека. Эта конструкция также должна обеспечивать доставку генов в клетки. Такие генетические конструкции созданы. С использованием их в принципе «лечебные» гены можно вводить и в половые клетки. Методы переноса генов в половые клетки широко используются при создании трансгенных животных. При таком переносе приобретенные гены будут передаваться потомству. Этот подход вполне оправдан при работе с животными. При лечении же человека на современном этапе развития науки такой подход неприемлем. Неизвестно как поведет себя перенесенный ген.

Может произойти гиперэкспрессия гена, или же он может нарушить работу других генов.

В настоящее время при лечении человека с ис пользованием методов генотерапии, гены вводят в соматические клетки. Поскольку при этом не транс формируются половые клетки, приобретенные гены не мо гут передаваться по наследству. Потомство, таким образом, оказывается защищенным от ошибки.

Введение генетической конструкции в соматические клетки осуществляется двумя способами:

• в предварительно выделенные и культивируемые клетки пациента, которые после трансформации возвращают в организм (генотерапия ex vivo);

• «лечебный» ген может быть введен в клетки непо средственно в организме больного (генотерапия in vivo).

Последовательность этапов генотерапии ex vivo сле дующая:

1) извлечение клеток из организма больного;

2) введение генетической конструкции в изолированные клетки;

3) отбор и наращивание «вылеченных» клеток;

4) возвращение генетически исправленных клеток в организм пациента.

Использование собственных клеток больного при проведении генно-терапевтических процедур не приводит к их отторжению иммунной системой после возвращения в организм.

Удобным объектом для проведения генотерапии ex vivo являются клетки костного мозга. В костном мозге присутствуют стволовые клетки, которые могут дифференцироваться в различные типы клеток: В- и Т-лимфоциты, эритроциты, макрофаги, тромбоциты, остеокласты. Если патология связана с нарушением генетических функций вышеуказан ных клеток, то введение в стволовые клетки соответствующих конструкций может оказать лечебное действие. Проведение терапии включает следующие этапы: извлечение костного мозга из организма больного, выделение из него стволовых клеток, введение в них конструкции с «лечебным» геном, возвращение трансформированных стволовых клеток на прежнее место. «Вылеченные» стволовые клетки дадут начало клеткам, в которых исходный генетический дефект отсутствует. Так может быть достигнут лечебный эффект.

Еще одним объектом для генотерапии ex vivo могут являться клетки печени. При проведении генно-терапевти ческих процедур у пациента отсекают 10 – 15 % печени. Затем из нее выделяют гепатоциты. На следующем этапе в культиви руемые гепатоциты вводится генетическая конструкция. На заключительной стадии трансформированные гепатоциты возвращают в печень через кровеносные сосуды.

В случае генотерапии in vivo введение генетической конструкции осуществляется в клетки пациента непо средственно в составе ткани без их выделения из органа.

Генетическая конструкция должна содержать «лечебный»

ген и промотор, обеспечивающий его экспрессию. Разрабо таны разнообразные методы доставки чужеродной ДНК в клетки тканей различных органов (мышцу, легкие, селезенку, печень, мозг, кожу, кишечник и др.).

Способы доставки «лечебных генов» в клетки Введение «лечебных генов» в клетки пациентов может быть осуществлено с использованием рекомбинантных вирусов. На основе генетического материала вирусов создано множество генно-инженерных конструкций, используемых для доставки генов в клетки. Наибольшее распространение имеют векторы, полученные на основе ретровирусов. Эти векторы обеспечивают высокую эффективность доставки ДНК в клетки и ее интеграцию в клеточный геном. Они при этом не наносят ощутимых повреждений клетке. При создании ретровирусных векторов удаляют нуклеотидные последовательности, кодирующие вирусные белки, обес печивающие формирование инфекционных вирусных частиц и лизис клеток. Взамен удаленного материала вводится «лечебный» ген. В составе ретровирусного вектора сохраняют элементы генома вирусов, обеспечивающие перенос и экспрессию трансгена. Сконструированный ретровирусный вектор дефектен. Он способен обеспечить доставку трансгенов, но не способен самостоятельно раз множаться. Размножаться же он может только в присутствии недефектного вируса-помошника. Еще к недостаткам ретровирусного вектора относится и то, что ретровирусы эффективно инфицируют только активно делящиеся клетки, и то, что ретровирусная ДНК интегрирует в геном клеток беспорядочно. Беспорядочное включение ретровирусной ДНК может привести к ее интеграции в функционирующий клеточный ген и подавить его активность.

С целью получения рекомбинантных ретровирусов, свободных от недефектных вирусов-помощников, были созданы «упаковывающие клетки». Они содержат гены ретровирусов, удаленные при создании ретровирусных векторов и, соответственно синтезируют ретровирусные белки, необходимые для формирования ретровирусной частицы. После введения в «упаковывающие клетки» ДНК ретровирусного рекомбинантного вектора она встраивается в хромосому и транскрибируется с образованием рекомбинантной векторной ретровирусной РНК. Пос ледняя, взаимодействуя с ретровирусными белками, синтезируемыми «упаковывающими клетками», формирует вирусные частицы. Такие вирусные частицы способны заражать клетки-мишени и их можно использовать для доставки «лечебных» генов в геном клетки-мишени. Следует отметить, что «упаковывающие клетки» не способны продуцировать вирусные частицы дикого типа. Что является весьма важной особенностью, потому что они (вирусные частицы дикого типа) могут нанести вред клеткам пациента.

Для доставки «лечебных» генов могут быть также использованы векторы, созданные на основе аденовирусов.

Аденовирусы способны инфицировать неделящиеся клетки.

Кроме того, они обладают широкой видовой и тканевой специфичностью. При создании векторов, из генома аденовирусов удаляют часть генетического материала, и вместо него вводится «лечебный» ген. Аденовирусные векторы в отличие от ретровирусных в геном не интег рируют, они присутствуют в ядре клеток, где осуществляется их транскрипция.

Получены векторы, используемые для доставки «лечебных» генов, и на основе других вирусов, например, на основе аденоассоциированных вирусов и вируса простого герпеса.

Наряду с вирусными векторами разработаны не вирусные методы доставки «лечебных генов». К таким методам относится обычная инъекция генетической конструкции (например, плазмидного вектора) в ткань какого-либо органа. Чужеродная ДНК при этом проникает только в часть клеток. Использование липосом, заполненных раствором векторной ДНК, может облегчить проникнове ние трансгена внутрь клеток. Это определяется тем, что липосомы способны сливаться с клеточной мембраной.

Можно использовать также метод биобаллистики для доставки трансгена в клетки тех или иных тканей. Введен ные таким образом «лечебные» гены в тканях-мишенях могут экспрессироваться. Для доставки «лечебного» гена в культивируемые клетки может использоваться также кальцийфосфатная трансфекция или метод электропора ции. Введение трансгена можно осуществлять с использованием комплекса ДНК с белками, для которых на поверхности клеток имеются соответствующие рецепторы.

После связывания белка с рецептором чужеродная ДНК проникает в клетку-мишень.

Следует отметить, что невирусные системы доставки трансгенов характеризуются низкой частотой трансформации и короткой продолжительностью экспрессии «лечебного»

гена. Эти два серьезных недостатка существенно влияют на перспективность их использования в генотерапии.

Достижения и перспективы генотерапии Первый пациентом генетических терапевтов (14.09.90) была четырехлетняя девочка с наследственным иммунодефицитом, обусловленным мутацией в гене аде нозиндезаминазы. Ей были пересажены ее собственные лимфоциты, трансформированные ex vivo геном аде нозиндезаминазы в составе ретровирусного вектора.

Терапевтический эффект наблюдался несколько месяцев, поэтому терапевтическая процедура повторялась через 3 – 5 месяцев. За три года терапии ей были проведены процедуры. Девочка, благодаря лечению, смогла вести нормальный образ жизни.

В последствие проводилось лечение и других пациен тов с наследственным иммунодефицитом. Им «лечебный»

ген вводили в Т-лимфоциты или в стволовые клетки костного мозга, которые предварительно извлекали и культивировали в пробирке. Неповрежденный ген аденозиндезаминазы в клетки вводили при помощи ретровирусного вектора. После трансформации клетки возвращали в организм больных.

После такой процедуры наблюдался лечебный эффект.

Болезнь Гоше или глюкозилцерамидный липидоз является одной из лизосомных болезней накопления. В лизосомах содержится около 40 ферментов, ответственных за внут риклеточное расщепление различных макромолекул.

Мутации генов, кодирующих эти ферменты, приводят к тому, что субстраты этих ферментов накапливаются в лизосомах. Болезнь Гоше связана с недостаточностью фермента глюкоцереброзидазы. Глюкоцереброзидаза ката лизирует в макрофагах расщепление глюкоцеребрози-да, поэтому при недостаточности этого фермента в клетках накапливается глюкоцереброзид, а клетки в свою очередь постепенно оседают в печени, селезенке, костном мозге и иногда в легких. Происходит поражение органов. Возможно лечение данного заболевания с помощью методов гено терапии. С этой целью в культивируемые клетки костного мозга необходимо ввести ген глюкоцереброзидазы и затем генетически скорректированные клетки доставить в организм больного.

Семейная гиперхолестеринемия является наслед ственным заболеванием. У больных на мембранах клеток печени отсутствует рецептор липопротенов низкой плотности (ЛПНП-рецептор). Как известно ЛПНП являются переносчиками холестерина в крови. ЛПНП-рецептор связывает ЛПНП и обеспечивает поглощение холестерина клетками печени посредством эндоцитоза. При отсутствии или недостатке рецептора в крови повышается содержание ЛПНП, что значительно увеличивает риск возникновения атеросклероза. Радикальное лечение семейной гиперхо лестеринемии возможно с помощью генотерапии. В этом случае лечение осуществляется следующим образом. У больных отсекают около 15 % печени (200 – 300 г). Отсеченную часть промывают раствором коллагеназы для разделения гепатоцитов, которые затем выращивают на питательной среде. В процессе роста в культуре, в клетки вводят в составе ретровирусного вектора недефектный ген ЛПНП-рецептора.

После трансформации модифицированные гепатоциты через воротную вену возвращают в печень. После опи санной процедуры, часть клеток печени больного начинают продукцию ЛПНП-рецептора, что обеспечивает снижение холестерина в крови пациентов.

Муковисцидоз – наследственное заболевание, обуслов ленное мутацией гена муковисцидозного трансмембранного регулятора, приводящее к тяжёлым нарушениям функций органов дыхания и желудочно-кишечного тракта. При лечении муковисцидоза методами генотерапии in vivo неповрежденную копию гена, включенную в аденовирусный вектор или липосому, вводят в виде аэрозоля в дыхательные пути больного.

Прогрессирующая мышечная дистрофия Дюшенна – за болевание мальчиков, определяется дефектом гена дист рофина, находящегося в Х-хромосоме. Дети с этим за болеванием испытывают прогрессирующую слабость мышц, обычно приводящую к их гибели от дыхательной или сердечной недостаточности в возрасте до 30 лет. При геннотерапевтическом лечении данного заболевания использовали два похода:

•недефектный ген дистрофина вводили in vivo с помощью инъекций в мышечные волокна, используя либо «голую» ДНК, либо в составе аденовирусного вектора;

• недефектный ген дистрофина в составе ретровирус ного вектора вводили ex vivo в миобласты, которые после генетической коррекции трансплантировали больному.

В обоих случаях удавалось получить временный лечебный эффект. После лечения дети могли двигаться, однако терапевтическая процедура должна неоднократно повторяться.

Смертность от онкологических заболеваний занимает второе место в мире после сердечно-сосудистых заболеваний.

Причиной онкологических заболеваний являются му тации, затрагивающие генетический аппарат клетки, и приводящие к трансформации нормальных клеток в злокачественные. Последние, с одной стороны, теряют способность к апоптозу, а с другой стороны – приобретают способность к бесконтрольному делению. Если иммунная система организма не распознает злокачественные клетки вовремя, то они начинают размножаться и метастазировать, образуя многочисленные опухоли. Онкологические забо левания часто заканчиваются летальным исходом. В настоящее время используют различные приемы для их лечения. Также разрабатываются приемы их генотерапии.

Для достижения лечебного эффекта можно генетически модифицировать как опухолевые клетки опухоли, так и нормальные клетки, например, клетки иммунной системы с целью активации иммунного ответа, направленного против опухоли. Возможны следующие приемы генетической коррекции лечения онкологических заболеваний:

• предотвращение экспрессии онкогенов в опухолевых клетках. Онкогены кодируют онкобелки, участвующие в трансформации нормальных клеток в опухолевые. Экс прессию онкогенов можно блокировать, если ввести гены, кодирующие антисмысловые РНК, комплементарные иРНК онкобелков. Для подавления экспрессии онкогенов в геном опухолевых клеток можно также ввести гены, продукты которых будут связывать онкобелки и таким образом их инактивировать;

• введение в опухолевые клетки генов-супрессоров опухолевого роста. В опухолевых клетках часто гены-суп рессоры повреждены. Поэтому замена дефектной копии гена на нормальную может оказать терапевтический эффект.

Значительная часть онкологических заболеваний связана с нарушением экспрессии гена p53. Его важнейшей функцией является запуск апоптоза в клетках с измененным геномом.

Оказалось, что восстановление экспрессии гена p53 может привести к уменьшению или исчезновению злокачественных опухолей;

• введение в опухолевые клетки «генов-убийц», про дукты которых обеспечивают гибель опухолевых клеток.

Тимидинкиназа вируса простого герпеса модифицирует субстрат ганцикловир в токсический для клетки продукт.

Введение гена тимидинкиназы в опухолевые клетки делает их чувствительными к ганцикловиру. Они погибают в присутствии этого вещества;

• активация клеток иммунной системы. В этом случае подразумевается введение в клетки иммунной системы генов стимуляторов иммунного ответа (интерферонов, интерлей кинов);

• повышение иммунореактивности опухолевых клеток за счет введения в них таких чужеродных генов, продукты которых, оказавшись на поверхности опухолевых клеток, позволят вызвать или усилить на них (опухолевые клетки) иммунный ответ;

• защита стволовых клеток от токсического действия химиотерапии. Для достижения этой цели в геном стволовых клеток вводят гены, определяющие устойчивость к лекарствам. При использовании этого подхода можно проводить химиотерапию более интенсивно.

Амавроз Лебера (врожденная слепота) – наследственное заболевание сетчатки глаза, проявляющееся уже в мла денчестве. Причиной заболевания является наличие дефект ного гена RPE65 (Retinal Pigment Epithelium, 65 kDa). Дефект гена RPE65 приводит к нарушению синтеза ферментов, участвующих в образовании светочувствительного пиг мента, и гибели светочувствительных клеток. Лечение этого заболевания возможно с помощью генотерапии.

Положительный результат был получен после инъекции вирусного вектора, содержащего исправленный ген в эпителий пигментного слоя сетчатки пациентов. У некоторых пациентов зрение восстановилось до такой степени, что они могли нормально учиться в школе и заниматься спортом.

Гемофилия является наследственным заболеванием, при котором нарушен процесс свёртывания крови. При этом заболевании могут происходить кровоизлияния в различных органах человека. Причиной гемофилии является мутация в генах свертываемости крови. Различают гемофилию А и гемофилию В. Гемофилия А связана с мутацией в гене фактора свертываемости крови VIII и, соответственно, с отсутствием этого белка в крови больно го. Причиной гемофилии В является мутация в гене фактора свертываемости крови IX. Лечение гемофилии в настоящее время осуществляют с помощью инъекций факторов свёртываемости крови, обычно выделенных из донорской крови. При генотерапии гемофилии В трансформации подвергали клетки кожи фибробласты. В норме эти клетки не производят фактор свертываемости крови IX. После введения гена фактора IX фибробласты имплантировали в кожу. Трансформированные фибробласты осуществляли синтез фактора IX.

Гемоглобин состоит из четырех субъединиц (двух альфа-глобинов и двух бета-глобинов) и гема. У больных бета-талассемией нарушен синтез бета-глобин, из-за мутации в его гене. Для генетической коррекции необходимо ввести ген бета-глобина и добиться, чтобы белок синтезировался в равных количествах с альфа-глобином.

Болезнь Паркинсона – нейродегенеративное заболева ние, характеризующееся прогрессирующим разрушением и гибелью дофаминовых нейронов в центральной нервной системе. В развитии болезни Паркинсона определенную роль играют генетическая предрасположенность и воздействие нейротоксинов, образующихся в самих дофаминовых нейронах. Причинами проявлений этого заболевания могут быть и факторы воздействия окружающей среды, хрони ческая цереброваскулярная недостаточность, употребление некоторых лекарств. Инъекции гамма-аминомасляной кислоты (нейромедиатора, оказывающего тормозящее действие, ГАМК) в мозг приводят к подавлению симптомов болезни Паркинсона (скованности движений, нарушений координации движений, дрожи и т.д.). Эффект такого лечения непродолжителен, так как нейромедиатор быстро выво дится. Синтез ГАМК осуществляет глутаматдекарбоксилаза.

В связи с этим введение дополнительных копий генов этого фермента в клетки должно привести к продолжительному увеличению продукции ГАМК.

Алкоголизм имеет огромное негативное влияние на все человечество. Общество испокон веков ведет борьбу с ним, но по большей части безуспешно. Возможно, в этой борьбе окажут помощь ДНК-технологии. В организме человека этанол при действии фермента алкогольдегидрогеназы превращается в ацетальдегид, который далее метаболи зирует в уксусную кислоту. Последнюю реакцию катализирует фермент альдегиддегидрогеназа. Ацеталь дегид значительнее токсичнее этанола и уксусной кислоты.

Его накопление в организме приводит к тяжелому отравле нию, сопровождающемуся головокружением, тошнотой, рвотой и другими неприятными симптомами. Если снизить скорость утилизации ацетальдегида, то при приеме алкого ля он будет накапливаться в большем количестве, чем обычно, что приведет к резкому ухудшению самочувствия. Снизить скорость утилизации ацетальдегида можно за счет пониже ния выроботки альдегиддегидрогеназы. Можно ожидать, что увеличение содержания ацетальдегида в организме приведет к формированию стойкого отвращения к алкоголю. Синтез альдегиддегидрогеназы можно подавить, если в клетки ввести генетические конструкции, кодирующие антисмысловые РНК, комплементарные иРНК альдегиддегидрогеназы. Та кие эксперименты были проведены на животных. Ученым удалось у крыс с врожденной склонностью к алкоголизму снизить потребление алкоголя на 50 %.

С целью иммунизации человека и животных является перспективным создание ДНК-вакцин. ДНК вакцины представляют собой генетические конструкции, кодирующие антигены возбудителей инфекционных за болеваний. При иммунизации конструкции должны быть доставлены в ядра клеток in vivo. В качестве клеток-мишеней при ДНК-вакцинации предпочтительнее использовать мышечные или эпителиальные клетки. Доставка может осуществляться методом биобаллистики или с помощью липосом, содержащих вакцину. Внутри клеток генети ческие конструкции обеспечивают синтез чужеродного белка, на который иммунная система способна вырабатывать антитела. Эти антитела и будут обеспечивать иммунитет к соответствующим возбудителям инфекционного забо левания. Возможна разработка многокомпонентных вак цин, генетические конструкции которых содержат гены, кодирующие антигены нескольких возбудителей инфекци онных заболеваний.

1. Баранов, В.С. Пренатальная диагностика наследственных и врож денных болезней в России. Реальность и перспективы / В.С. Баранов // Соровский образовательный журнал. – 1998. – № 10. – С. 32 – 36.

2. Биохимия. Краткий курс с упражнениями и задачами / под ред.

Е.С. Северина, А.Я. Николаева. – М.: Гэотар-Мед. 2001. – 448 с.

3. Бокуть, С.Б. Молекулярная биология / С.Б. Бокуть, Н.В. Ге расимович, А.А. Милютин. – Минск: Выш. шк., 2005. – 463 с.

4. Глазер, В.М. Конверсия гена / В.М. Глазер // Соросовский образо вательный журнал. – 2000. – № 1. – С. 23 31.

5. Глик, Б. Молекулярная биотехнология. Принципы и приме нение / Б. Глик, Дж. Пастернак. – М., 2002. – 585 с.

6. Гончаренко, Г.Г. Основы генетической инженерии / Г.Г. Гон чаренко. – Минск: Выш. шк., 2005. – 183 с.

7. Ермишин, А.П. Генетически модифицированные организмы / А.П. Ермишин. – Минск: Тэхналогiя, 2004. – 118 с.

8. Инге-Вечтомов, С.Г. Введение в молекулярную генетику / С.Г. Инге-Вечтомов. – М.: Высшая школа. 1983. – 343 с.

9. Коничев, А.С. Молекулярная биология / А.С. Коничев, Г.А. Се вастьянова. – М.: Издательский центр «Академия», 2005. – 400 с.

10. Кухта, В.К. Биологическая химия / В.К. Кухта, Т.С. Морозкина, Э.И. Олецкий, А.Д. Таганович. – М., Минск: Бином. 2008. – 688 с.

11. Ленинджер, Л. Основы биохимии / Л. Ленинджер. – М.: Мир, 1985. – Т. 1 – 3.

12. Льюин, В. Гены / В. Льюин. – М.: Мир, 1987. – 544 с.

13. Молекулярная биология клетки / Б. Альбертс [и др.]. – М.: Мир, 1986 – 1987. – Т. 1 – 5.

14. Молекулярная биология: структура и биосинтез нуклеиновых кислот / В.И. Агол;

под ред. А.С. Спирина. – М.: Высшая школа. 1990. – 352 с.

15. Сингер, М. Гены и Геномы / М. Сингер, П. Берг. – М.: Мир, 1998.

16. Халимская, Л.М. Химический синтез белков и нуклеиновых кислот с использованием автоматических синтезаторов / Л.М. Халимская // Соровский образовательный журнал. – 2000. – № 10. – С. 37 – 42.

17. Шелкунов, С.Н. Генетическая инженерия / С.Н. Шелкунов. – Но восибирск: Сиб. унив. изд-во, 2008. – 514 с.

18. Жимулев, И. Ф. Общая и молекулярная генетика / И.Ф. Жиму лев. – Новосибирск: Сиб. унив. изд-во, 2002. – 458 с.

19. Янковский, Н.К. Молекулярно-генетические методы в руках детектива, или опыт исследования останков семьи последнего рос сийского императора / Н.К. Янковский // Соровский образовательный журнал. – 1996. – № 2. – С. 21 – 27.

* Литература из списка была использована при написании данного пособия

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение

Список принятых сокращений

Глава 1. Определение нуклеотидной последовательности ДНК

Метод А.Максома и В.Гилберта (химический метод)

Метод Ф.Сангера (энзиматический метод)

Глава 2. Синтез ДНК

Химический синтез ДНК

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

ПЦР с обратной транскрипцией

ПЦР в реальном времени

Глава 3. ДНК-диагностика

ДНК-диагностика с использованием меченых гибридизационных зондов

ДНК-фингерпринтинг

Диагностика инфекционных заболеваний

ДНК-диагностика генетических заболеваний

ДНК-диагностика генетических заболеваний с использованием гибридизационных зондов

ДНК-диагностика серповидноклеточной анемии

Обнаружение однонуклеотидных замен с использованием методов ПЦР и лигирования олигонуклеотидных зондов (ПЦР/ЛОЗ)...... Идентификация мутаций в разных участках одного гена с помощью нескольких гибридизационных зондов

Идентификация биологических останков с использованием молекулярно-генетического анализа с целью выявления их принадлежности к определенной семье

Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии.. Ферменты в генетической инженерии

Ферменты, фрагментирующие ДНК

Нуклеазы

Ферменты, синтезирующие ДНК на матрице ДНК или РНК

ДНК-полимераза

Обратная транскриптаза

Ферменты, лигирующие фрагменты ДНК

ДНК-лигаза

Ферменты, модифицирующие концы НК

Терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза

ПолиА-полимераза

Фосфатазы

Полинуклеотидкиназа

Методы в генетической инженерии

Получение генов

Введение гена в вектор и получение рекомбинантного вектора

Плазмидные векторы

Фаговые векторы

Космиды

Фазмиды

Челночные векторы

Векторы, используемые для введения чужеродной ДНК в клетки животных..... Векторы, используемые для введения чужеродной ДНК в клетки растений... Введение рекомбинантного вектора в клетки модифицируемого организма...... Получение ГМО

Глава 5. Генная инженерия прокариот

Экспрессия генов, клонированных в клетках прокариот.................. Практическое применение генетически модифицированных бактерий

Генетически модифицированные бактерии на службе медицины.. Лекарственные препараты

Инсулин

Гормон роста (соматотропин)

Рекомбинантные вакцины

Роль генетически модифицированных бактерий при создании диагностических средств в медицине

Использование генетически модифицированных бактерий для получения продуктов немедицинского назначения.................. Биодеградация токсических веществ с помощью генетически модифицированных бактерий

Глава 6. Эукариотические системы экспрессии чужеродных генов

Генная инженерия дрожжей

Экспрессия чужеродных генов в культурах клеток насекомых........ Экспрессия чужеродных генов в культурах клеток млекопитающих

Глава 1. Определение нуклеотидной последовательности ДНК Глава 7. Генная инженерия растений

Практическое применение трансгенных растений

Трансгенные растения, устойчивые к гербицидам

Трансгенные растения, устойчивые к насекомым-вредителям........ Трансгенные растения, устойчивые к вирусам

Трансгенные растения, устойчивые к патогенным грибам и бактериям

Повышение устойчивости растений к стрессовым условиям........... Трансгенные растения с измененными пищевыми качествами...... Трансгенные растения «биореакторы»

Глава 8. Генная инженерия животных

Перспективы использования трансгенных животных................. Трансгенные животные – «биореакторы»

Трансгенные животные с улучшенными характеристиками........... Трансгенные животные, устойчивые к заболеваниям

Создание животных – генетических моделей заболеваний человека

Глава 9. Генотерапия

Способы доставки «лечебных генов» в клетки пациентов................. Достижения и перспективы генотерапии

Рекомендуемая литература

ПРИКЛАДНАЯ МОЛЕКУЛЯРНАЯ

БИОЛОГИЯ

Подписано в печать 05.01.2011. Формат 6084/16.

Бумага офсетная. Ризография. Гарнитура Palatino Linotype.

Усл. печ. л. 9,77. Уч.-изд. л. 8,9. Тираж 150 экз. Заказ Учреждение образования «Гродненский государственный ISBN 978-985-515-430- 9 789855 15430

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 ||
 




Похожие материалы:

«МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ САРАТОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ Н.И. ВАВИЛОВА АГРАРНАЯ НАУКА В XXI ВЕКЕ: ПРОБЛЕМЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ Сборник статей VIII Всероссийской научно-практической конференции САРАТОВ 2014 1 УДК 378:001.891 ББК 4 Аграрная наука в XXI веке: проблемы и перспективы: Сборник ста тей VIII Всероссийской научно-практической конференции. / ...»

«из ФОНДОВ РОССИЙСКОЙ ГОСУДАРСТВЕННОЙ БИБЛИОТЕКИ А5аев, Василий Васильевич 1. Параметры текнолозическозо процесса оБраБотки почвы дисковым почвооБраБатываютцим орудием 1.1. Российская государственная Библиотека diss.rsl.ru 2003 Л5аев, Василий Васильевич Параметры текнологического процесса о5ра5отки почвы дисковым почвоо5ра5атываю1цим орудием [Электронный ресурс]: Дис. . канд. теки, наук : 05.20.01 .-М.: РГЕ, 2003 (Из фондов Российской Государственной Библиотеки) Сельское козяйство — Меканизация ...»

«Министерство сельского хозяйства РФ Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Мичуринский государственный аграрный университет Б.И. Смагин, С.К. Неуймин Освоенность территории региона: теоретические и практические аспекты Мичуринск – наукоград РФ, 2007 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com УДК 332.122:338.43 ББК 65.04:65.32 С50 Рецензенты: доктор экономических наук, профессор И.А. Минаков доктор ...»

«УДК 634.42:631.445.124 (043.8) Инишева Л.И. Почвенно-экологическое обоснование комплексных мелиораций. – Томск: Изд-во Том. Ун-та, 1992, - 270с.300 экз. 3804000000 В монографии представлен подход к мелиоративному проектированию комплексных мелиораций с позиции генетического почвоведения. На примере пойменных почв южно- таежной подзоны в пределах Томской области рассматриваются преимущества данного подхода в мелиорации. Проведенные исследования на 4 экспериментальных мелиоративных системах в ...»

«МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Пермская государственная сельскохозяйственная академия имени академика Д.Н. Прянишникова И.А. Самофалова СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ КЛАССИФИКАЦИИ ПОЧВ Учебное пособие Допущено Учебно-методическим объединением вузов Российской Федерации по агрономическому образованию в качестве учебного пособия для подготовки магистров, обучающихся по направлению ...»

«Н. В. Гагина, Т. А. Федорцова МЕТОДЫ ГЕОЭКОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ Курс лекций МИНСК БГУ 2002 1 УДК 550.8 ББК 26.3 Г12 Р е ц е н з е н т ы: кафедра физической географии Белорусского государственного педагогического университета им. М. Танка; заведующий научно-исследовательской лабораторией экологии ландшафтов Белорусского государственного университета, доцент, кандидат сельскохозяйственных наук В. М. Яцухно; Печатается по решению Редакционно-издательского совета Белорусского государственного ...»

«У к р а и н с к а я академия аграрных наук Национальный научный центр И н с т и т у т почвоведения и а г р о х и м и и им. А . Н . С о к о л о в с к о г о В. В. Медведев Твердость почвы Х А Р Ь К О В - 2009 УДК 631.41 В.В.Медведев. Твердость почв. Харьков. Изд. КГ1 Городская типо- графия, 2009, 152 с. Книга написана с целью популяризации твердости почв и ее более ши рокого использования в почвоведении, земледелии и земледельческой меха нике. Рассмотрены факторы, влияющие на твердость, ...»

«МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ УЧРЕЖДЕНИЕ ОБРАЗОВАНИЯ ГРОДНЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ХV МЕЖДУНАРОДНАЯ НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ СОВРЕМЕННЫЕ ТЕХНОЛОГИИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОГО ПРОИЗВОДСТВА МАТЕРИАЛЫ КОНФЕРЕНЦИИ (Гродно, 27 апреля, 18 мая 2012 года) В ДВУХ ЧАСТЯХ ЧАСТЬ 2 ЭКОНОМИКА БУХГАЛТЕРСКИЙ УЧЕТ ТЕХНОЛОГИЯ ХРАНЕНИЯ И ПЕРЕРАБОТКИ ОБЩЕСТВЕННЫЕ НАУКИ Гродно ГГАУ 2012 УДК 631.17 (06) ББК М ХV М е ж д у н а р о д н а я ...»

«Министерство образования Республики Беларусь Учреждение образования Гомельский государственный университет имени Франциска Скорины Т. А. Колодий, П. В. Колодий ЛЕСОЭКСПЛУАТАЦИЯ Практическое руководство по подготовке и оформлению курсовых проектов для студентов специальности 1-75 01 01 Лесное хозяйство Гомель УО ГГУ им. Ф. Скорины 2010 УДК ББК К Рецензенты: технический инспектор труда Гомельского обкома профсоюза работников леса, С. П. Поздняков; доцент кафедры лесохозяйственных дисциплин ...»

«Е.В. Шеин КУРС ФИЗИКИ ПОЧВ Рекомендовано УМО по классическому университетскому образованию в качестве учебника для студентов высших учебных заведений, обучающихся по направлению 510700 Почвоведение и специальности 013000 Почвоведение ИЗДАТЕЛЬСТВО МОСКОВСКОГО УНИВЕРСИТЕТА 2005 УДК 631 ББК 40.3 Ш 39 Печатается по решению Ученого совета Московского университета Федеральная целевая программа Культура России на 2005 г. (подпрограмма Поддержка полиграфии и книгоиздания России) Рецензенты Заведующий ...»

«Раздел 1. КОРМЛЕНИЕ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ И ТЕХНОЛОГИЯ КОРМОВ УДК 636.4.084 СБАЛАНСИРОВАННОСТЬ РОССЫПНЫХ КОМБИКОРМОВ ДЛЯ СВИНОМАТОК А.А. ХОЧЕНКОВ РУП Научно-практический центр НАН Беларуси по животноводству г. Жодино, Минская обл., Республика Беларусь, 222160 (Поступила в редакцию 20.12.2009) Введение. Современная комбикормовая промышленность Беларуси для кормления свиноматок выпускает как россыпные, так и гранули рованные комбикорма. Обе формы комбикормов имеют свои достоин ства и ...»

«МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ АССОЦИАЦИЯ ИСПЫТАТЕЛЕЙ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ ТЕХНИКИ И ТЕХНОЛОГИЙ (АИСТ) СРАВНИТЕЛЬНЫЕ ИСПЫТАНИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ ТЕХНИКИ Москва 2013 УДК 631.3-048.24 ББК 40.72 С 75 Под общ. ред. председателя ассоциации испытателей сельскохозяйственной техники и технологий (АИСТ) В.М. Пронина Авторы: П.И. Бурак, В.М.Пронин, В.А.Прокопенко, А.А.Медведев, Т.Б. Микая, С.Н. Киселев, М.Н.Жердев, Г.А.Жидков, В.И.Масловский, В.В.Конюхов, Л.В.Колодин, ...»

«ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ ГОУ ВПО ВОЛГОГРАДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ВОЛЖСКИЙ ГУМАНИТАРНЫЙ ИНСТИТУТ (ФИЛИАЛ) ВОЛГУ А.С. Акишин, М.М. Подколзин, А.С. Акишин Земельные ресурсы России и Волгоградской области и формирование новой аг- ропродовольственной политики (2005—2012 годы) Учебное пособие ВОЛГОГРАДСКОЕ НАУЧНОЕ ИЗДАТЕЛЬСТВО 2008 338.43 УДКУДК ББК 65.32-51+65.281 А39 Научный редактор д-р с.-х. наук, проф. Л.И. Сергиенко [ВГИ (филиал) ВолГУ] Рецензенты: д-р экон. наук, проф. ...»

«И.Г. Крымская Гигиена и экология человека Соответствует Федеральному государственному образовательному стандарту (третьего поколения) Среднее профессиональное образование И. Г. К р ы м ск ая ГИ ГИ Е Н А И ЭКОЛОГИЯ ЧЕЛО ВЕКА Учебное пособие Рекомендовано Международной Академией науки и практической организации производства в качестве учебного пособия для студентов образовательных учреждений среднего профессионального образования Издание 2-е, стереотипное Ростов-на-Дону Феникс 2012 УДК ...»

«Вы – свет мира Евангелие от Матфея, глава 5, стих 14 И, зажегши свечу, не ставят ее под сосудом, но на подсвечнике, и светит всем в доме. Евангелие от Матфея, глава 5, стих 15 Книга издана при поддержке Благотворительного фонда “Під покровом Богородиці”. Вы – свет мира Очерки жизни Владимира Леонидовича Бандурова Запорожье 2013 УДК 63(477.64)(092)Бандуров В. Л. ББК 65.9(4 Укр–4 Зап 5 Пол)32-03д В 92 Вы – свет мира. Очерки жизни Владимира Леони В 92 довича Бандурова / Н. Кузьменко, В. Манжура, ...»

«Министерство сельского хозяйства Российской Федерации Министерство сельского хозяйства и продовольстия Свердловской области ФГБОУ ВПО Уральская государственная сельскохозяйственная академия XIII МЕЖДУНАРОДНАЯ НАУЧНО–ПРАКТИЧЕСКАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ СТУДЕНТОВ, АСПИРАНТОВ И МОЛОДЫХ УЧЕНЫХ МОЛОДЕЖЬ И НАУКА 2011 Участие молодых ученых в реализации Государственной программы развития сельского хозяйства и регулирования рынков сельскохозяйственной продукции, сырья и продовольствия на 2008–2012 годы ...»

«Министерство Природных Ресурсов Федеральная служба по надзору в сфере природопользования Государственный природный заповедник Полистовский УДК Утверждаю: Директор заповедника Регистрационный № _ Яблоков М.С. Инвентарный № __2009 г. Тема: Динамика явлений и процессов в природном комплексе заповедника ЛЕТОПИСЬ ПРИРОДЫ Книга 9 2008 год Стр. Ст. научный сотрудник Черевичко А.В. Карт. Фото Диагр. 30 мая 2009 г. СОДЕРЖАНИЕ Территория заповедника 1. Пробные и учётные площади, ключевые участки, ...»

«Министерство Природных Ресурсов Федеральная служба по надзору в сфере природопользования Государственный природный заповедник Полистовский УДК Утверждаю: Директор заповедника Регистрационный № _ Яблоков М.С. Инвентарный № __2008 г. Тема: Динамика явлений и процессов в природном комплексе заповедника ЛЕТОПИСЬ ПРИРОДЫ Книга 8 2007 год Стр. 124 Ст. научный сотр. Ларионова С.Ю. Карт. Фото Диагр. 2 12 декабря 2008 г. СОДЕРЖАНИЕ Территория заповедника 1. Пробные и учётные площади, ключевые участки, ...»

«Министерство Природных Ресурсов Федеральная служба по надзору в сфере природопользования Государственный природный заповедник Полистовский УДК Утверждаю: Директор заповедника Регистрационный № _ Яблоков М.С. Инвентарный № __2008 г. Тема: Динамика явлений и процессов в природном комплексе заповедника ЛЕТОПИСЬ ПРИРОДЫ Книга 7 2006 год Стр. 111 Ст. научный сотр. Ларионова С.Ю. Карт. Фото Диагр. 6 8 февраля 2008 г. СОДЕРЖАНИЕ Территория заповедника 1. Пробные и учётные площади, ключевые участки, ...»






 
© 2013 www.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.