WWW.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 

Pages:     | 1 | 2 || 4 |

«Министерство образования Республики Беларусь УЧРЕЖДЕНИЕ ОБРАЗОВАНИЯ «ГРОДНЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ ЯНКИ КУПАЛЫ» В.И. ...»

-- [ Страница 3 ] --

При интеграции чужеродного гена в экспрессирующийся ген вектора существует опасность попадания не в рамку считывания. Синтезированный белок с такой ДНК не будет иметь ничего общего с чужеродным белком. В связи с этим при встраивании чужеродного гена необходимо убедиться, чтобы он попал в рамку считывания.

Рис. 5.2. Интеграция чужеродного гена в экспрессирующийся ген вектора Гибридные белки часто не обладают биологической активностью чужеродных белков, поэтому существует необходимость выщепления последних из гибридных белков.

Эту проблему можно разрешить, если к белку клетки-хозяина присоединить короткий пептид, узнаваемой протеазой небактериального происхождения. Такое присоединение программируется на уровне ДНК. После синтеза и очистки гибридного белка фрагмент белка клетки-хозяина и пептид отделяется с помощью специфической протеазы (рис. 5.3).

Так можно выщепить чужеродный белок из гибридного.

Рис. 5.3. Схема, иллюстрирующая кодирование гибридного белка, экспрессию сконструированной генетической конструкции с последующим выщеплением чужеродного белка с помощью специфической протеазы В некоторых случаях гибридные белки сохраняют актив ность чужеродного белка. Тогда возможно их использование без удаления маркерного пептида.

В процессе роста популяции часть клеток может утра тить рекомбинантную плазмиду. Бесплазмидные клетки, как правило, растут быстрее и постепенно вытесняют клетки, содержащие рекомбинантную плазмиду. Через какое-то время количество продукта клонированного гена в культуре постепенно снижается. И в конечном итоге он вообще перестает синтезироваться. Для решения проблемы утраты рекомбинантной плазмиды в вектор можно встроить ген устойчивости к антибиотику, и выращивать бактерии в среде с антибиотиком. Тогда рекомбинантная плазмида в культуре клеток будет сохраняться. В то время как клетки, утратившие ее, погибнут из-за наличия антибиотика в среде.

Использование антибиотиков в промышленных условиях сильно увеличивает стоимость конечного продукта. С целью удешевления используют другие селективные среды, на которых бактерии без рекомбинантной плазмиды расти не могут, или встраивают ген в хромосому. Интеграция чужеродного гена в хромосому бактериальной клетки позволяет обойтись без плазмид и избежать утраты клони рованных генов. Для интеграции в хромосому вводимый чужеродный ген должен иметь полинуклеотидную последовательность (приблизительно 50 нуклеотидов) сходную с полинуклеотидной последовательностью участ ка хромосомы, в пределах которого планируется его встраивание. Интеграция гена в хромосому осуществляется в результате гомологичной рекомбинации. После встраива ния чужеродного гена трансформированные клетки отбирают и далее используют.

Можно добиться секреции чужеродных белков бактериальными клетками в окружающую среду. Секре тируемые белки часто оказываются более стабильными, чем не секретируемые. Кроме того, для выделения и очистки чужеродных белков не нужно разрушать клетки, что значительно упрощает эти процедуры. Для получения секретируемых белков нужно присоединить к чужеродному гену участок ДНК, кодирующий сигнальную последовательность. Эта последовательность обеспечивает секрецию белков. В процессе секреции белков сигнальная последовательность отщепляется, а чужеродный белок выходит из клетки. Следует отметить, что наличие сигнальной последовательности не всегда определяет эффективную секрецию чужеродных белков. Особенно сложно добиться секреции чужеродных белков грамотрицательными бактериями, к ним относится и E.coli. Грамотрицатель ные бактерии окружены двумя мембранами: внутренней и внешней. Между ними находится периплазматическое пространство, заполненное периплазмой. Для получения секретируемого интерлейкина-2 поступили следующим образом. Ген интерлейкина-2 соединили с геном пол норазмерного предшественника мальтозосвязывающего белка, содержащего сигнальную последовательность.

Между этими генами поместили сегмент ДНК, кодирую щий сайт узнавания для протеазы Ха. Такой химерный ген интегрировали в вектор. Затем им трансформировали E.coli.

В периплазме трансформированных клеток был выявлен химерный белок. После его обработки специфической протеазой был получен функционально активный интер лейкин-2.

Интересен еще один подход, позволяющий добиться секреции чужеродных белков грамотрицательными бактериями. Известно, что белок грамотрицательных бак терий – бактериоцин – активирует локализованную во внутренней мембране фосфолипазу А. В результат такой активации наружная и внутренняя мембраны становятся более проницаемы для белков. Если ген бактериоцина встроить в вектор и им трансформировать клетки E.coli, то мембраны последних станут более проницаемыми. Можно также в состав того же самого (или другого вектора) ввести ген чужеродного белка с присоединенной нуклеотидной последовательностью, кодирующей сигнальный пептид.

Бактерии, содержащие активно транскрибирующие гены бактериоцина и чужеродного белка, будут секретировать последний в окружающую среду.

Наличие в клетке чужеродных генов и их экспрессия часто приводят к метаболической перегрузке и ухудшению роста клеточной культуры. Что в конечном итоге может привести к снижению выхода чужеродного белка. В случае метаболической перегрузки возрастает вероятность тран сляционных ошибок, что может сказаться на качестве белка. Метаболическую перегрузку можно снизить, если использовать малокопийные плазмиды или встроить чуже родные гены в хромосому. Уменьшить метаболическую перегрузку можно и используя регулируемые промоторы.

В этом случае во время роста клеточной культуры промотор находится в выключенном состоянии. После наращивания клеточной массы промотор включается в результате воз действия какого-либо фактора.

Таким образом, процесс получения генетически модифицированных бактерий, обладающих полезными характеристиками, является сложнейшей процедурой, тре бующей огромных затрат интеллектуального труда.

Практическое применение генетически модифицированных бактерий Генетически модифицированные бактерии находят широкое применение во многих областях деятельности человека. Их используют для получения лекарственных препаратов, создания вакцин, для синтеза витаминов, аминокислот, антибиотиков и многих других веществ. Они оказывают неоценимую услугу при деградации токсических соединений и утилизации биомассы, в сельском хозяйстве.

Генетически модифицированные бактерии на службе медицины В настоящее время с помощью ДНК-технологий удается получать лекарственные препараты на основе белков человека в ощутимых количествах, достаточных для полного удовлетворения в их потребности. В то время как до эры ДНК-технологий были серьезные ограничения при лечении некоторых заболеваний человека, связанные с недостатком такого рода лекарств. В настоящее время клонировано сотни генов белков человека, которые потенциально могут быть использованы в медицине. Для десятков белков уже получено одобрение на их применение в качестве ле карственных препаратов (таблица 5.1). Надо отметить, что прежде чем какой-либо белок будет использован для лечения человека, он подвергается тщательной проверке.

Вначале проводят ее на животных, и только потом осуществляются продолжительные клинические испытания.

Пройдет не один год с тех пор, как белок, полученный с помощью генетически модифицированных бактерий, после интенсивных исследований будет использован для лечения человека.

Белки, разрешенные для использования в качестве лекарственных препаратов для лечения человека Тканевой активатор плазминогена Острый инфаркт миокарда, острая Рассмотрим в качестве примера биотехнологические способы получения инсулина и гормона роста.

Инсулин является гормоном поджелудочной же лезы. Он регулирует углеводный обмен и поддерживает нормальный уровень глюкозы в крови. Его недостаток в организме приводит к тяжелому заболеванию сахарному диабету, который является широко распространенным недугом и как причина смерти стоит на третьем месте после сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний. В настоящее время более 100 млн. человек болеют диабетом.

Простое введение инсулина в организм человека позволяет нивелировать данное заболевание. В связи с широкой распространенностью сахарного диабета, существует необхо димость в получении инсулина в больших количествах. Эту проблему позволяет решить биотехнологический синтез гормона.

Молекула инсулина образована 51 аминокислотным остатком и состоит из двух полипептидных цепей А и В, связанных между собой двумя дисульфидными мостиками.

Цепь А содержит 21 аминокислотный остаток, цепь В – остатков. Синтезируется он в клетках островков Лангерганса в виде одноцепочечного предшественника препроинсулина.

В процессе созревания (рис. 5.4) вначале отщепляется N-кон цевой сигнальный пептид (24 аминокислотных остатка) и образуется проинсулин (86 остатков), в котором А- и В-цепи соединены С-пептидом. Затем происходит удаление С-пеп тида, в результате проинсулин превращается в инсулин.

Инсулин является первым белком, полученным для коммерческих целей с использованием генетически модифицированных бактерий. Существует две основные стратегии для получения инсулина человека с помощью ДНК-технологий. В соответствии с первой стратегией в различные штаммы-продуценты вводятся по отдельности последовательности ДНК, кодирующие соответственно А- и В-цепи инсулина. В результате одни продуценты синтезируют только А-цепи, другие – В-цепи. Далее синтезированные А- и В-цепи выделяют и из них собирают функционально активный гормон. При этом между цепями также как и в природном гормоне формируются дисульфидные мостики.

Согласно второй стратегии с помощью генетически моди фицированных бактерий получают проинсулин (рис. 5.5), из которого с помощью протеаз вычленяют инсулин.

Более предпочтительной является вторая стратегия, обес 0печивающая более эффективный синтез гормона.

При использовании обеих стратегий возможно как индивидуальное получение исходных полипептидов (А- и В-цепи или проинсулин), так и в составе гибридных белков.

При использовании определенных подходов из гибридного белка вырезают инсулин (рис. 5.5). В составе гибридных белков могут содержаться также последовательности, обеспечивающие его транспорт в периплазматическое про странство клетки или культуральную среду.

Рис. 5.5. Схема получения инсулина согласно второй стратегии.

Амп – ген устойчивости к ампицилину. -гал – ген -галоктазидазы Гормон роста синтезируется клетками гипофиза в виде предшественника с относительной молекулярной массой 28 000. В процессе созревания от предшественника отщепляются полипептидные последовательности. Гор мон роста состоит из 191 аминокислотного остатка и имеет относительную молекулярную массу около 22 000.

Его недостаток приводит к заболеванию – гипофизарной карликовости, которое встречается с частотой 1 случай на 5 000 человек. Поскольку гормон обладает видовой специфичностью, указанное заболевание можно лечить, используя лишь человеческий гормон. Раньше его полу чали из гипофиза трупов. Гормона хватало лишь для лечения трети случаев гипофизарной карликовости в развитых странах. Больному требуется для лечения в течение года гормон роста в количестве, полученном из гипофизов 60 умерших.

В настоящее время гормон роста синтезируют с помощью ДНК-технологий. Одна из многочисленных схем получения гормона роста с помощью ДНК-технологий представлена на рис. 5.6. На первом этапе из клеток гипо физа выделяли мРНК предшественника гормона. Далее, используя метод обратной транскрипции, синтезировали кДНК, из которой на следующем этапе удаляли область, кодирующую сигнальный пептид. Полученный ген, ко дирующий полипептидную последовательность гормона, интегрировали в вектор, так чтобы перед геном находились промотор и последовательность Шайна-Дальгарно. Затем рекомбинантным вектором трансформировали клетки E.coli. Трансформированные клетки осуществляли синтез гормона роста. Так с помощью методов генетической инженерии удалось получить гормон роста.

Рис. 5.6. Схема получения гормона роста человека с помощью ДНК технологий Генетически модифицированные бактерии можно использовать и для получения вакцин. Последние применяются для формирования иммунитета к патогенным микроорганизмам. В ответ на введение вакцины в организме вырабатываются антитела к патогенным микроорганизмам, которые впоследствии защищают его (организм) от инфекционного заболевания, обеспечивая обезврежи вание патогенных микроорганизмов. С появлением вакцин многие инфекционные заболевания удалось взять под контроль и многократно снизить число заболевших. В настоящее время большинство вакцин создаются на основе либо инактивированных, либо невирулентных штаммов.

Существуют еще так называемые химические вакцины.

Они представляют собой извлеченные из микроорганизмов отдельные компоненты, которые и определяют иммуноген ные свойства микроорганизма.

Несмотря на огромное значение вакцин в подавлении инфекционных заболеваний, их использование сдержи вается некоторыми ограничениями:

• при нарушении технологического процесса в вакци ны могут попасть живые или недостаточно ослабленные вирулентные микроорганизмы, которые способны вызвать тяжелые заболевания и привести к распространению инфекции;

• невирулентные штаммы могут ревертировать к ис ходному штамму;

• не все патогенные микроорганизмы удается куль тивировать, поэтому для заболеваний, вызванных такими микроорганизмами, вакцины не созданы;

• для некоторых заболеваний нельзя создавать тради ционные вакцины (СПИД).

С помощью ДНК-технологий можно получить новое поколение вакцин. Для достижения этой цели используют методы генной инженерии. Существует разные подходы для получения таких вакцин:

• из генома патогенного микроорганизма удаляется ген, ответственный за вирулентность. Такой микроорганизм можно использовать в качестве живой вакцины, потому что он не вызывает заболевание, но сохраняет способность вызывать иммунный ответ. Кроме того он не может ревертировать к исходному штамму, потому что у него удален целый ген, определяющий заболевание;

•можно создать непатогенные системы, обес печивающие перенос отдельных антигенных детерминант какого-либо патогенного микроорганизма. Такие системы могут обеспечить развитие иммунного ответа на патоген ный микроорганизм, при этом являться безопасными;

• можно поступить и следующим образом: выделить ген, кодирующий белок патогенного микроорганизма. Кло нировать его (ген) в альтернативном хозяине (например, в E.coli) и добиться его экспрессии с образованием микроорганизменного белка. Последний после выделения и очистки можно использовать в качестве вакцины. В этом случае необходимо работать с генами белков, определяющих антигенные свойства микроорганизма. Только такие белки могут вызвать стойкий иммунитет. Такие вакцины безопасны, поскольку в них отсутствуют дополнительные белки и НК, которые могли бы являться причиной нежелательных побочных явлений у вакцинируемых.

• в качестве вакцин перспективны пептидные вак цины. Определенные домены белковой молекулы могут выступать в качестве антигенной детерминанты и вызы вать образование антител. В связи с этим возможно вакцинирование не полномерной молекулой белка, а лишь ее частью – доменом. Выработанные на него антитела будут обезвреживать патогенный микроорганизм, домен белка которого был использован в качестве вакцины. При получении пептидных вакцин с помощью ДНК-технологий клонируется не целый ген, а лишь последовательности ДНК, кодирующие его домен. Очевидна безопасность таких вакцин и их перспективность.

Роль генетически модифицированных диагностических средств в медицине Важную роль генетически модифицированные бак терии играют при создании диагностических средств в ме дицине. Широкое применение для выявления возбудителей инфекционных заболеваний имеет так называемый иммуноферментный анализ (сокращённо ИФА, англ. en zyme-linked immunosorbent assay, ELISA). О наличии того или иного возбудителя в организме человека можно судить по наличию антител в крови к этому возбудителю, потому что после проникновения патогенного микроорганизма в организм человека его иммунная система вырабатывает антитела, специфичные к данному возбудителю. В случае наличия антител можно говорить об инфицировании человека соответствующим микроорганизмом.

В основе метода ИФА лежит принцип специфического взаимодействия между антигеном и соответствующим ему антителом. Существует несколько способов постановки ИФА. Рассмотрим наиболее часто используемый подход для выявления специфических антител в крови, включающий следующие этапы (рис. 5.7).

• Антиген возбудителя фиксируется на твердой под ложке, обычно в лунке тест-планшета.

•В лунку добавляется тестируемая сыворотка или плазма крови. При наличии в них специфических антител (первых антител) к антигену возбудителя происходит их связывание с образованием двойного комплекса «антиген – первое антитело». Затем лунку промывают, чтобы удалить не связавшийся материал.

• В лунку добавляют вторые антитела, к которым присоединен фермент (например, щелочная фосфатаза, пероксидаза хрена, уреаза), катализирующий превращение неокрашенного субстрата в окрашенный продукт. Вторые антитела специфичны к первым. Происходит образование тройного комплекса «антиген – первое антитело – второе антитело-фермент». Затем лунку промывают, чтобы удалить не связавшийся материал.

•В лунку добавляют неокрашенный субстрат. При нали чии тройного комплекса «антиген – первое антитело – второе антитело – фермент» происходит превращение неокрашен ного субстрата в окрашенный продукт.

• Осуществляют качественное или количественное определение продукта реакции. Количество окрашенного продукта пропорционально количеству антител к антигену возбудителя. Чем выше концентрация антител в крови, тем будет большим образование продукта.

При отсутствии антител в исследуемой сыворотке или плазме двойной и тем более тройной комплексы образовываться не будут. Следовательно, окрашенный продукт в лунке не будет образовываться. Так по наличию или отсутствию окраски можно судить о присутствии или отсутствии в крови антител к возбудителю. И в конечном итоге о присутствии или наличии возбудителя в организме человека.

Рис. 5.7. Принципиальная схема ИФА. АГ – антиген, АТ 1 – первые антитела, АТ 2 – вторые антитела, ЩФ – щелочная фосфатаза В качестве антигенов при ИФА могут быть использованы нативные антигены, полученные при раз рушении возбудителя инфекции, рекомбинантные белки, полученные генно-инженерным способом, и являющиеся белками-аналогами определенных антигенов возбудителя, и химически синтезированные фрагменты белков возбуди теля. В настоящее время в качестве антигена все больше и больше используются рекомбинантные белки, потому что технология их получения позволяет их синтезировать в чистом виде и достаточном количестве. Специфичность некоторых рекомбинантных тест-систем приближается к 100 %.

С помощью ИФА осуществляется диагностика раз личных инфекций: ВИЧ-инфекция, вирусные гепатиты, цитомегаловирусная, герпесная, токсоплазменная и другие инфекции.

С помощью генетически модифицированных бак терий также получают ДНК-зонды, используемые в ДНК диагностике. С целью получения зонда, специфичного к ДНК какого-либо возбудителя поступают следующим образом. ДНК патогенного микроорганизма с помощью рестриктазы расщепляют на фрагменты. Фрагменты вводят в вектор, которым трансформируют бактериальные клетки.

Затем бактерии, содержащие рекомбинантный вектор, размножают. С увеличением числа клеток увеличивается также число молекул рекомбинантного вектора, а сле довательно, и число фрагментов ДНК патогенных бактерий.

Далее из бактериальных клеток выделяют рекомбинантный вектор и из него с помощью той рестриктазы, которая использовалась для фрагментации ДНК, вырезают фрагмент ДНК патогенного микроорганизма, который в последствие используют в качестве зонда.

Использование генетически модифицированных бактерий немедицинского назначения Генетически модифицированные бактерии можно использовать и для получения продуктов немедицинского назначения. С их помощью могут быть синтезированы продукты как белкового происхождения, так и небелкового (витамины, аминокислоты, красители, антибиотики и т.д.).

С целью получение рекомбинантных ДНК ис следователи в своей работе применяют сотни различных рестриктаз. Многие из них синтезируют с помощью ДНК технологий. Однако такой способ получения рестриктаз сталкивается с определенными проблемами. Введение гена рестриктазы в составе рекомбинантного вектора в бактерию может оказаться губительным для нее, потому что в ее геномной молекуле ДНК будут присутствовать сайты ре стрикции, узнаваемые рестриктазой, экспрессирующейся с чужеродного гена. Тогда хозяйская ДНК будет расщеплять ся ею. Одним из подходов, позволяющих защитить бак териальную ДНК от деградации рестриктазой, является введение в бактериальную клетку гена гомологичной метилазы – фермента метилирующего ДНК в области сайтов рестрикции. Метилированная ДНК не расщепляется рестриктазой. Таким образом, наличие соответствующего гена метилазы защитит клетку.

Аминокислоты имеют широкое применение в различных отраслях промышленности. Они используются в качестве усилителей вкуса и аромата, пищевых и кормовых добавок, в медицине, в химической промышленности при синтезе полимеров и т.д. В промышленности, главным образом, аминокислоты получают из белковых гидролизатов или как продукты метаболизма Corynebacterium или Brevibac terium. С целью повышения продуктивности этих бактерий, целесообразно введение в них модифицированных генов ферментов биосинтеза аминокислот. Направленная моди фикация генов может обеспечить повышенный синтез соответственной аминокислоты.

Широкое применение в фармацевтической, пере рабатывающей и пищевой промышленности имеют биополимеры. Некоторые из них получают с помощью микроорганизмов. С использованием ДНК-технологий существует возможность создания генетически модифи цированных бактерий, продуцирующих биополимеры с улучшенными характеристиками и в больших количествах.

Бактерия Xanthomonas campestris продуцирует био полимер ксантановую слизь (полисахарид). Ее можно использовать в качестве стабилизирующего, загущающего, эмульгирующего или суспендирующего вещества. С целью удешевления производства ксантановой слизи бактерии целе сообразно выращивать на дешевой питательной среде – молочной сыворотке – побочном продукте, образующемся при производстве сыра и содержащем лактозу. Однако X. campestris не могут в качестве источника углерода эффективно использовать этот дисахарид. Проблему можно разрешить, если в бактериальные клетки ввести в составе рекомбинантного вектора гены ферментов, участвующих в метаболизме лактозы, -галактозидазы и лактозопермиазы. Таким образом трансформированные бактерии приобретают способность расти на сыворотке и продуцировать ксантановую слизь в больших количествах.

Еще один полимер, значение которого трудно переоценить, это каучук, также может быть получен с помощью трансгенных бактерий. Его биосинтез включает 17 ферментативных стадий. В связи с этим очевидно, какую сложную задачу нужно решить, чтобы получить микроорганизмы, продуцирующие этот полимер.

Можно создать с помощью ДНК-технологий мик роорганизмы, синтезирующие другие полимеры и низкомолекулярные вещества (витамины, антибиотики).

Для достижения этой цели в микроорганизмы необходимо ввести все или часть генов ферментов, ответственных за синтез вещества, которое исследователь хочет получить с помощью трансгенного микроорганизма.

Биодеградация токсических веществ модифицированных бактерий Некоторые микроорганизмы обладают природной способностью к деградации различных токсических веществ.

Например, бактерии рода Pseudomonas содержат плазмиды, кодирующие ферменты, разрушающие ароматические и галогенсодержащие органические соединения. Природную способность таких бактерий можно усилить, используя приемы генной инженерии. Так Чакрабарти и его сотрудники создали бактериальный штамм, расщепляющий большинство углеводородов нефти, и получивший название «супербациллы». Штамм был получен благодаря манипуляциям с плазмидами, кодирующими ферменты деградации определенных углеводородов. Результатом таких манипуляций явилось объединение нескольких плазмид в одной клетке. Созданный штамм растет на нефти лучше, чем исходные штаммы, послужившие донорами плазмид.

Большинство бактерий, разрушающих токсические вещества, хорошо растут при температуре 20 – 40 °С. В природ ных условиях обезвреживание токсических веществ прихо дится осуществлять при более низких температурах – 0 – 20°С.

С целью создания бактерий, способных расти при низких температурах, плазмиду TOL, ответственную за разрушение толуола мезофильного (хорошо растущего при средних температурах) штамма Pseudomonas putida, перенесли с помощью конъюгации в психрофильный (хорошо растущий при низких температурах) штамм. Трансформированный штамм обладал способностью утилизировать толуол при низкой температуре.

Усилить природную способность микроорганизмов к деградации токсических веществ можно также в результате модификации генов, кодирующих ферменты какого-либо метаболического пути.

Глава 6. ЭУКАРИОТИЧЕСКИЕ СИСТЕМЫ

ЭКСПРЕССИИ ЧУЖЕРОДНЫХ ГЕНОВ

Не всегда удается в прокариотических клетках получить рекомбинантные эукариотические белки, обладающие биологической активностью. В связи с этим были разработаны эукариотические системы эксп-рессии чужеродных генов. В качестве эукариотических систем синтеза чужеродных белков используются дрожжи и культуры клеток животных. Отсутствие биологической активности эукариотических белков, синтезированных в клетках прокариот, определяется отсутствием у них систем, обеспечивающих посттрансляционные модификации белков (гликозилирование, образование дисульфидных мостиков, ограниченный протеолиз, фосфорилирование, ацетилирование и др.). К эукариотическим векторам предъявляются следующие требования. Они должны иметь эукариотический селективный маркер, эукариотический промотор, эукариотические сайты терминации транс ляции и транскрипции, сигнал полиаденилирования иРНК.

В качестве векторов могут быть использованы плаз миды. Они должны нести сайт инициации репликации, функционирующей в эукариотической клетке. Вектор может быть также предназначен для встраивания в ге номную ДНК эукариот. В этом случае он должен иметь нуклеотидную последовательность, гомологичную тако вой участку ДНК, в который планируется встраивание вектора. Интеграция вектора в геном будет происходить по механизму гомологичной рекомбинации. Часто используют челночные векторы, способные существовать как в клетках прокариот, так и в клетках эукариот (рис. 6.1).

Рис. 6.1. Схема организации челночного вектора. ГУА – ген устойчивости к антибиотику (селективный маркер E.coli), ori Euk – эукариотический сайт инициации репликации, ori E.coli – сайт инициации репликации E.coli Для введения вектора в клетки эукариот используют различные подходы. При трансформации дрожжей в одних случаях векторную ДНК добавляют к их протопластам – клеткам, у которых удалена клеточная стенка химическим или ферментативным способом. В других случаях клетки дрожжей предварительно (перед добавлением экзогенной ДНК) обрабатывают ацетатом лития или используют метод электропорации. В клеточные культуры животных введение чужеродной ДНК осуществляют посредством инкубации клеток с ДНК, осажденной фосфатом кальция или ДЕ-АЕ-декстраном, а также с помощью электропорации.

Для доставки ДНК в эукариотические клетки могут быть также использованы вирусы.

Широко используются в генной инженерии обычные дрожжи Saccharomyces cerevisiae. Это обусловлено рядом причин:

• они хорошо изучены;

•содержат 2 мкм-плазмиды, которые можно исполь зовать для создания экспрессирующихся векторов;

• в клетках дрожжей осуществляются различные пост трансляционные модификации.

трансгенных дрожжей, нашли практическое применение.

Глава 6. Эукаритические системы экспрессии чужеродных генов В качестве вакцин используются поверхностный антиген вируса гепатита В, белок малярийного плазмодия, белок HIV-1. Как лекарственные препараты применяются инсулин, тромбоцитарный фактор роста, фактор XIIIа системы свертываемости крови, a1-антитрипсин, коло ниестимулирующий фактор гранулоцитов и макрофагов и др. В молекулярной диагностики используются белок виру са гепатита С и антигены HIV-1.

В генной инженерии дрожжей для доставки чуже родной ДНК используют плазмидные векторы, векторы, интегрирующие в геномную ДНК, и искусственные дрожжевые хромосомы (YAC). Последние применяются для клонирования больших фрагментов ДНК (порядка 100 т.п.н.). YAC-вектор содержит сайт инициации реп ликации, центромерную область и теломеры, может нести селективный маркер.

В клетках дрожжей удаление интронов происходит не эффективно, в связи с этим при клонировании генов целесообразно использовать кДНК или химически синтезированные гены.

Чужеродные белки, синтезируемые в клетках дрожжей, могут аккумулироваться в них или секретироваться в окружающую среду. Гликозилированию в дрожжевых клетках подвергаются только секретируемые белки. С це лью получения секретируемых белков перед нуклеотидной последовательностью, кодирующей чужеродный белок, нужно расположить нуклеотидную последовательность, кодирующую сигнальную последовательность. Последняя способна обеспечить транспорт рекомбинантного белка через клеточную мембрану. В процессе транспорта через мембрану в молекуле белка образуются дисульфидные связи, осуществляются другие посттрансляционные модификации, а также отщепляется сигнальная последовательность.

Кроме Saccharomyces cerevisiae могут использоваться и другие дрожжевые системы экспрессии чужеродных генов.

Так, в генной инженерии нашли применение дрожжи Kluyveromes lactis, Schizosaccharomyces pombe и др.

Экспрессия чужеродных генов в культурах клеток насекомых В клетках насекомых могут развиваться бакуловирусы.

Они способны существовать в двух формах. Первая форма представлена отдельными вирионами, вторая – множеством вирионов, объединенных белковым матриксом. Матрикс образован белком полиэдрином. Сразу после инфекции формируются отдельные вирионы, которые, высвобождаясь из инфицированных клеток, заражают другие клетки насекомого. По прошествии определенного времени начинается синтез полиэдрина. После лизиса клеток вирионы высвобождаются и оказываются заключенными в белковый матрикс, защищающий их от гибели. Если другое насекомое поглотит такую частицу, то после солюбилизации полиэдрина высвободившиеся вирионы способны начать новый цикл инфекции.

Ген полиэдрина находится под контролем чрез вычайно сильного промотора. При этом цикл развития бакуловирусов не зависит от присутствия в его геноме гена полиэдрина. В связи с этим инфицирование куль туры клеток насекомого рекомбинантным вирусом, в геноме которого ген полиэдрина заменен чужеродным эукариотическим геном, может привести к синтезу боль шого количества рекомбинантного белка. Поскольку системы посттрансляционных модификаций насекомых и млекопитающих сходны, то рекомбинантный белок, синтезированный в клетках насекомых, может оказаться по своей организации близким или идентичным природному белку, образующемуся в естественных условиях. Опираясь на вышеизложенную стратегию, в настоящее время на основе бакуловирусов разработаны векторы для экспрес сии генов млекопитающих. При использовании векторов, созданных на основе бакуловирусов, получены сотни различных белков, более 95 % из которых имели правиль ные посттрансляционные модификации.

Глава 6. Эукаритические системы экспрессии чужеродных генов В генной инженерии нашел широкое применение вирус множественного ядерного полиэдроза Autogra pha californica (AcMNPV). Одна из стратегий создания рекомбинантного AcMNPV следующая. Вначале на основе плазмиды E.coli создается так называемый транспортный вектор. В составе транспортного вектора (рис. 6.2) содер жатся промотор бакуловируса, сайт клонирования, в который встраивается чужеродный ген, сайт терминации полиаденилирования, обеспечивающий терминацию транс крипции и полиаденилирование иРНК. Перед промотором и за сайтом терминации-полиаденилирования встраивают фрагменты ДНК бакуловируса AcMNPV, прилегающие к гену полиэдрина. На следующем этапе в сайт клонирова ния транспортного вектора встраивают чужеродный ген (рис. 6.2).

Рис. 6.2. Схема организации транспортного вектора и Транспортный вектор с чужеродным геном используют для введения последнего в состав ДНК бакуловируса (рис. 6.3).

Между ДНК AcMNPV и транспортным вектором возможна гомологичная рекомбинация, поскольку их молекулы имеют гомологичные последовательности нуклеоти дов. В результате такой рекомбинации ген полиэдрина замещается чужеродным геном. При этом рекомбинантный вирус приобретает способность обеспечивать синтез чуже родного белка и в то же время становится не способным продуцировать полиэдрин.

Рис. 6.3. В результате гомологичной рекомбинации между транспортным вектором и AcMNPV ген полиэдрина замещается чужеродным геном В настоящее время разработаны и другие методики получения рекомбинантных бакуловирусов. Созданы чел ночные векторы, позволяющие осуществлять все манипу ляции с генами в клетках Е.coli, а синтез белка проводить в клетках насекомых.

Глава 6. Эукаритические системы экспрессии чужеродных генов Экспрессия чужеродных генов в культурах клеток млекопитающих В настоящее время созданы внехромосомные векторы млекопитающих. Основное их назначение: полу чение рекомбинантных белков в медицинских целях и использование для исследования функций и регуляции генов млекопитающих. По своей организации они сходны с дру гими экспрессирующимися эукариотическими векторами (рис. 6.1). Они могут быть челночными и содержать два сайта инициации репликации, один из которых ответственен за репликацию вектора в клетках прокариот, другой – эукариот, два селективных маркера (прокариотический и эукариотический), полилинкер, в состав которого встраи вается чужеродный ген, эукариотический промотор и сайт терминации-полиаденилирования. В качестве регуляторных последовательностей эукариотических генов (промоторы, сайт терминации-полиаденилирования) обычно применяют таковые млекопитающих или вирусов животных. При этом предпочтительнее используются сильные промо торы и эффективные сигналы полиаденилирования.

В качестве селективного прокариотического маркера часто используются гены устойчивости к антибиотикам.

В качестве эукариотических селективных маркеров могут использоваться различные гены, например, гены неомицинфосфотрансферазы (НФТ), глутаминсинтетазы (ГС), дигидрофолатредуктазы (ДГФР) и др.

НФТ способна фосфорилировать токсичное вещество генетицин, которое в результате этой процедуры теряет свою токсичность. В связи с этим клетки, продуцирующие НФТ, способны расти в среде, содержащий генетицин, в то время как клетки, не синтезирующие этот фермент, гибнут в присутствии данного токсина. Эту особенность можно использовать для отбора клеток, содержащих реком бинантный вектор с селективным геном НФТ, от клеток, не содержащих соответствующий вектор.

лавливает устойчивость к токсическому действию метионинсульфоксимина. Используя способность клеток, содержащих этот маркерный ген в составе рекомбинантного вектора, выживать в среде с указанным токсином, можно их отделить от клеток, не содержащих рекомбинантную плазмиду.

С помощью клеточных культур удалось получить разнообразные рекомбинантные белки. Синтезированы белки, состоящие из нескольких субъединиц. Для того чтобы клетки животных культур продуцировали белки, образованные двумя полипептидными цепями, необходимо в них ввести два вектора, которые содержали по одному гену каждой полипептидной цепи или один вектор, в составе которого представлены оба гена. Второй вариант предпочтительнее, потому что в этом случае легче достичь образования полипептидных цепей в одинаковых количествах.

Глава 7. ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ РАСТЕНИЙ Одной из важнейших особенностей растительной клетки является ее тотипотентность, благодаря которой из соматической клетки возможна регенерация фертильного растения. Поэтому, трансформировав одну отдельную клетку, можно из нее получить трансгенное растение, которое далее может размножаться и передавать трансген своим потомкам. Введение новых генов в геном растений осуществляют с различными целями:

• для улучшения сельскохозяйственных или декора тивных характеристик культурных растений;

• для получения чужеродных белков или других важных веществ;

• для научных исследований.

Первое в мире трансгенное растение санбин было получено Д.Кемпом и Т.Холлом в 1983 г в результате пере носа гена запасного белка бобовых (фазеолина) в геном подсолнечника. К настоящему моменту времени получены тысячи различных трансгенных растений. Некоторыми из них засеяны сотни миллионов гектаров.

Для конструирования трансгенного растения нужно:

• выделить или синтезировать ген;

• разработать методы введения гена в клетки растения;

• регенерировать из единичных клеток растение с из мененным генотипом.

Весьма сложной задачей является поиск генов, позволяющих придать растению какой-либо полезный признак. Например, устойчивость к гербицидам, насекомым, болезням и др. Обнаружив такие гены, необходимо получить их в достаточном количестве. Подробнее способы получения генов рассмотрены в теме «Получение генов». На следующем этапе необходимо ввести ген в растительную клетку. С этой целью широко применяются векторы, созданные на основе Ti-плазмиды Agrobackteria tumefaciens (см. тему «Векторы, используемые для введения чужеродной ДНК в клетки растений»). Наиболее простым вариантом создания ре комбинантного вектора на основе Ti-плазмиды является встраивание чужеродного гена в состав Т-ДНК. Обработка клетками Agrobackteria tumefaciens, содержащими такую ре комбинантную плазмиду, растительных клеток приведет к встраиванию в растительный геном Т-ДНК и вместе с ней чужеродного гена. Однако такие векторы имеют ряд недостатков. В составе Т-ДНК в клеточный геном интегри руют наряду с чужеродным геном и гены, ответственные за синтез фитогормонов. Последние затрудняют регенерацию зрелых растений из трансформированных клеток. Кроме того, Ti-плазмиды имеют значительные размеры, что вно сит определенные неудобства при работе с ними.

При создании более эффективных векторов на основе Ti-плазмиды из нее удаляют гены фитогормонов и другие несущественные последовательности ДНК. С целью прида ния способности таким векторам реплицироваться в клетках E.coli, в их состав вводится сайт инициации репликации E.coli. Также в состав вектора вводятся селективные маркеры, позволяющие отобрать клетки, содержащие вектор, и в пределах Т-ДНК полилин кер, необходимый для встраивания чужеродных генов (рис. 7.1). Такие векторы способны существовать как в клетках E. coli, так и в клетках Agrobackteria tumefaciens.

Все операции по клонированию проводят в клетках E.coli, а затем вектор вводят в Agrobackteria tumefaciens.

Рис. 7.1. Схема организации вектора на основе Ti-плазмиды Рассмотренные выше векторы на основе Ti-плаз миды не содержат vir-область, поэтому не способны самостоятельно обеспечивать транспорт и интеграцию Т ДНК в растительный геном. Чтобы решить эту проблему, разработано два подхода. В первом случае рекомбинантный вектор вводят в клетки Agrobackteria tumefaciens, содержа щие модифицированную неонкогенную Ti-плазмиду, в которой сохранена vir-область, но удалена часть ее Т-ДНК, в результате последняя (Т-ДНК) не может быть транспорти рована и интегрирована в геном растения. Неонкогенная плазмида, обеспечивая синтез всех белков, необходимых для транспорта Т-ДНК, выступает в качестве помощника, способствуя интеграции Т-ДНК рекомбинантного вектора в геном растения. При использовании второго подхода после введение рекомбинантного вектора в клетки Agrobac kteria tumefaciens, содержащие неонкогенную Ti-плазмиду, происходит гомологичная рекомбинация, в результате которой обе плазмиды объединяются. Вновь образованная плазмида несет чужеродный ген. В то же время она способна обеспечить транспорт и интеграцию Т-ДНК, содержащую чужеродный ген, в растительный геном.

Перенос генов с использованием Agrobackteria tumefaciens эффективны в случае работы с двухдольными растениями.

Что касается однодольных растений, то использование этих бактерий для их трансформации ограничено. В связи с этим применяются и другие методы переноса генов в растительные клетки. Наиболее широко используется метод биобаллистической трансформации. Также применяются векторы на основе вирусов, методы электропорации, микро инъекции, слияния липосом. Попав в клетку, чужеродная ДНК может интегрировать в растительный геном.

Для идентификации и отбора трансформированных клеток необходимы маркерные гены. Их продуктами являют ся легко идентифицируемые белки. В трансформированных клетках в отличие от нетрансформированных будет присут ствовать маркерный ген, а следовательно, и синтезироваться легко тестируемый белок. Учитывая эту особенность можно отличить трансформированные клетки от нетранс формированных. В качестве маркеров используются, как отмечалось ранее, гены люциферазы и GFP-белка. Могут для этой цели применяться гены ферментов. Наличие фермен тов легко выявить по их каталитической активности.

Перед чужеродным геном должен располагаться промотор, узнаваемый растительной РНК-полимеразой. В генной инженерии растений применяются конститутивные (постоянно функционирующие в клетке) или регулируемые (функционирующие на определенных стадиях развития растения, или в определенных тканях, или под действием некоторых факторов) промоторы. С целью усиления экспрессии чужеродных генов в вектор могут быть ин тегрированы энхансер, а также последовательности ДНК, кодирующие участки иРНК, обеспечивающие более эффективную трансляцию.

Чужеродные гены могут быть интегрированы в хлоропластную ДНК растений. С этой целью конструиру ется плазмидный вектор, содержащий чужеродный ген и селективный маркер, фланкированные нуклеотидными сегментами хлоропластной ДНК (рис. 7.2). Затем с использованием метода биобаллистической трансформации плазмидный вектор вводят в хлоропласты. Где посредством гомологичной рекомбинации между хлоропластной ДНК и сегментами хлоропластной ДНК плазмиды происходит интеграция чужеродного гена и селективного маркера в геном хлоропластов. Так чужеродный ген может быть включен в состав хлоропластной ДНК. Поскольку промото ры хлоропластных генов сходны с прокариотическими, но не с ядерными, перед чужеродным и маркерным генами необходимо поместить соответствующие нуклеотидные последовательности, обеспечивающие их транскрипцию.

Рис. 7.2. Схема организации плазмидного вектора, используемого для введения чужеродного гена в хлоропластную ДНК. ЧГ – чужеродный ген, СМ – селективный маркер, схДНК – сегменты хлоропластной ДНК Если первое трансгенное растение было получено в 1983, то в продаже первые трансгенные продукты появились в 1994 г. Ими были гербицид-устойчивая соя и томаты Fla vr Savr с замедленным созреванием. В настоящее время на сельскохозяйственных полях выращиваются генетически модифицированные кукуруза, соя, томаты, хлопчатник, картофель, табак, рапс, кабачки, редис и др. Общая пло щадь, занимаемая трансгенными растениями, составляет более 100 млн. га. С каждым годом происходит увеличение площадей, засеваемых генетически модифицированными растениями. Распределение выращиваемых культур сле дующее: соя – около 52 %, кукуруза – около 30 %, хлопок – около 13 %, рапс – около 5 %.

Одни трансгенные растения содержат дополнитель ные гены, улучающие их качества (гены устойчивости к гербицидам, вредителям, болезням, неблагоприятным условиям окружающей среды и др.). Другие выступают в качестве «биореакторов», производящих вещества, используемые в различных отраслях народного хозяйства.

К таким веществам могут относиться белки с высоким содержанием незаменимых аминокислот, жирные кислоты, модифицированные полисахариды, вакцины, антитела, интерфероны и др.

Гербициды в сельском хозяйстве применяются для борьбы с сорняками. Следует отметить, что гербициды способны подавлять рост не только сорных растений, но и культурных. Создание растений, устойчивых к гербицидам, позволяет решить проблему борьбы с сорняками. При обработке гербицидами посевов культур, устойчивых к ним (гербицидам), сорняки будут избирательно подавляться, а культурные растения будут нормально развиваться.

Устойчивость к гербицидам можно достичь за счет:

• снижения проникновения гербицида в растение;

• инактивации гербицида в растении;

• изменения структуры белка (или фермента), на который гербицид оказывает повреждающее действие.

В результате такого изменения белок (или фермент) оказывается полностью или в значительной степени не чувствительным к гербициду;

• усиленного синтеза белка (или фермента), чув ствительного к гербициду. В этом случае повышенное содержание белка (или фермента) нивелирует действие гербицида.

При создании растений, устойчивых к определенному гербициду, необходимо:

• идентифицировать мишень (белок или фермент), на которую воздействует гербицид;

•выявить организмы, устойчивые к гербициду;

•выделить ген из организмов, не чувствительных к гербициду, продукт которого определяет устойчивость к гербициду;

• создать вектор, содержащий ген, определяющий устойчивость к гербициду;

• ввести с помощью вектора в геном растения ген, определяющий устойчивость к гербициду.

В сельском хозяйстве нашел широкое применение гербицид глифосат. Он ингибирует фермент 5-енол пирувилшикимат-3-фосфатсинтазу (ЕПШФ), и тем самым подавляет синтез ароматических аминокислот. Гербицид воздействует только на растения, грибы и бакте-рии.

Кроме того, он быстро разрушается после попадания в почву. В связи с этим считается, он не опасен для человека.

Выявленные случаи устойчивости к глифосату связаны либо с повышением уровня синтеза ЕПШФ, либо с наличием в клетках растений мутантного фермента, нечувствительного к гербициду. Для создания трансгенных растений, устойчивых к этому гербициду, используют мутантные гены ЕПШФ.

С этой целью из организмов, устойчивых к глифосфату, выделяют ген, который используют для создания рекомбинантного вектора. С помощью рекомбинантного вектора в геном растения встраивают мутантный ген ЕПШФ, который и определяет у трансгенных растений устойчивость к глифосату. Трансгенные растения, устойчивые к глифосату, были получены также в результате сверхпродукции в их клетках фермента ЕПШФ или введения гена глифосфатокси доредуктазы, разрушающей гербицид.

Примером еще одного гербицида, устойчивость к которому достигается в результате его деградации, является бромоксинил. Бромоксинил подавляет фотосинтез. Устой чивость трансгенных растений к этому гербициду может быть достигнута в результате интеграции в их геном гена нитрилазы. Нитрилаза осуществляет разрушение бромоксинила.

устойчивые к насекомым-вредителям Бактерия Bacillus thuringiensis продуцирует протоксин (Bt-протеин), являющийся токсичным белком для насекомых, в то же время для млекопитающих он безопасен. Попав в пищеварительный тракт насекомого, молекула протоксина подвергается модификации (от нее отщепляется часть полипептидной цепи) и превращается в токсин. Токсин образует поры в клетках кишечника насекомых, что приводит к их лизису. Насекомое при этом погибает. В природе найдены различные штаммы В. thuringiensis. Интересно, что они синтезируют разные токсины, каждый из которых действует только на определенный вид насекомых.

Гены Bt-протеина были выделены из различных штаммов, в некоторых случаях они были существенно модифицированы, и использованы для создания трансгенных растений, устойчивых к насекомым-вредителям. Наиболее широко в сельском хозяйстве используются устойчивые к насекомым кукуруза и соя. При создании трансгенной кукурузы был использован промотор гена фосфоенол пируваткарбоксилазы, обеспечивающий экспрессию генов Bt-протеина только в зеленых тканях растения.

Получен также устойчивый к колорадскому жуку картофель. При создании трансгенного картофеля перед ге ном Bt-протеина поместили фоточувствительный промотор малой субъединицы рибулозо-1,5-бифосфаткарбокси лазы, обеспечивающий синтез Bt-протеина на свету в более эффективно, чем в темноте. В связи с этим в клубнях картофеля содержание Bt-протеина приблизительно в раз меньше, чем в листьях.

Для получения трансгенных растений, устойчивых к насекомым-вредителям, могут быть использованы гены ингибиторов амилаз и протеаз. Насекомые, поедающие трансгенные растения, продуцирующие такие ингибиторы, не способны переваривать пищу, потому что ингибиторы будут подавлять пищеварительные ферменты и тем самым препятствовать гидролизу крахмала и растительных белков.

Вирусы, также как насекомые и сорняки, существенно снижают урожайность культурных растений. В связи с этим создание трансгенных растений, устойчивых к вирусам, позволяет сохранить значительную часть урожая.

Устойчивость растениям к вирусам можно придать за счет введения в их геном генов, кодирующих белки оболочки вируса или других вирусных генов, а также антисмысловых последовательностей генома вирусов.

Трансгенное растение, продуцирующие белок обо лочки какого-либо вируса, оказывается защищенным от этого вируса. Способность вируса инфицировать такие растения часто значительно ослаблена. Механизм защиты точно не установлен. Посредством введения генов белков оболочки вирусов получены многочисленные трансгенные растения, устойчивые к вирусам. Некоторые из них нашли промышленное применение.

Для получения трансгенных растений, устойчивых к вирусам, могут быть использованы антисмысловые РНК.

Антисмысловая РНК комплементарна иРНК и способна с ней образовывать дуплекс, предотвращая тем самым трансля цию иРНК. В присутствии антисмысловой РНК синтез белка, закодированного в иРНК, подавляется. Если ввести в геном растений гены антисмысловых РНК, комплементарных к вирусным иРНК, то можно ожидать, что синтез вирусных белков ослабнет и, соответственно, развитие вирусов в клетках растений будет затруднено. Используя этот подход, можно защитить растения от вирусов.

Устойчивость растений к вирусам может быть также достигнута за счет введения в их геном генов про тивовирусных белков, синтезируемых растениями. Так, в клеточной стенке фитолакки американской присутствуют три противовирусных белка. Гены этих белков можно использовать для получения устойчивых к вирусам растений.

Трансгенные растения, устойчивые к патогенным грибам и бактериям Грибковые и бактериальные заболевания являются причиной существенных потерь урожая. С помощью методов генной инженерии возможно создание трансгенных растений, устойчивых к патогенным грибам и бактериям.

После проникновения патогенных организмов в клетки растений в них (растениях) образуются специфические белки, воздействующие на патогены. К таким белкам относятся хитиназа (разрушает хитин – основной компонент гри бов), -1,3-глюканаза (разрушает клеточную стенку грибов), тауматин (небольшой, сладкий на вкус белок, слаще сахарозы в 200 000 раз), ингибиторы протеаз.

Гены этих белков можно использовать для создания трансгенных растений. Так, введение генов хитиназы и -1,3-глюканазы в геном растений придает последним устойчивость к патогенным грибам.

Большой ущерб приносит урожаю картофеля бактерия Erwinia carotovora. С целью защиты картофеля в его геном был введен ген лизоцима (разрушает клеточную оболочку бактерий) бактериофага Т4. К гену был пришит промотор вируса мозаики цветной капусты, сигналы терминации и полиаденилирования и сигнальный пептид a-амилазы ячменя. Промотор обеспечивал транскрипцию, а сигнальный пептид – секрецию лизоцима в межклеточное пространство, в которое проникает патогенная бактерия.

Трансгенный картофель оказался устойчивым к Erwinia carotovora. Такой принцип создания трансгенных растений можно распространить и на другие объекты.

Повышение устойчивости растений В процессе жизненного цикла растения подвергаются воздействию различных неблагоприятных факторов окружающей среды: высоких и низких температур, засухи, засоления почв и т.д. Некоторые из растений приспособились преодолевать их негативное воздействие, другие – нет. Неблагоприятные факторы могут существен но снизить урожайность сельскохозяйственных культур.

С использованием методов генной инженерии возможно повысить устойчивость у растений к стрессовым условиям.

Можно повысить устойчивость растений к пони женным температурам. Бактерии Pseudomonas syringae сосуществуют с растениями и способствуют повреждению растений заморозками. В клетках этого микроорганизма синтезируется белок, молекулы которого находятся во внешней мембране и являются центром кристаллизации льда. Формирование кристаллов льда является фактором, определяющим повреждение тканей растений. Известны мутанты этих бактерий, потерявшие способность синтезиро вать этот белок. Растения с такой микрофлорой оказались более устойчивыми к заморозкам.

Важно получить растения, устойчивые к засухам, поскольку они могут все усилия производителей свести на нет. Одним из веществ, способных защитить растения от засухи или при высокой засоленности, является бетаин.

Он способствует поглощению и удерживанию воды растением. В одних растениях это вещество синтезируется в ощутимых количествах, в тоже время некоторые важные культурные растения (картофель, томаты, рис) не способ ны его накапливать. Придать растениям устойчивость к засухе и высокой засоленности почв можно введением в их геном генов ферментов, синтезирующих бетаин. Последний синтезируется из холина в две стадии. Первую стадию у растений катализирует фермент холинмонооксигеназа, вторую – бетаинальдегиддегидрогеназа. У E.coli обе стадии синтеза бетаина катализирует один фермент холиндегидрогеназа. Очевидно, что при создании транс генных растений предпочтительнее использовать ген холиндегидрогеназы. Растения, в геном которых был перенесен ген холиндегидрогеназы, были более устойчивы к высоким концентрациям солей, чем нетрансгенные растения.

с измененными пищевыми качествами Используя ДНК-технологии, можно повлиять на пищевую ценность растений: изменить аминокислотный состав пищевых белков, получить плоды с измененным жирнокислотным составом, создать сорта картофеля с улучшенным качеством крахмала, придать определенный вкус плодам.

Растения являются продуцентами наиболее дешевых белков. Однако их пищевая ценность невысока, поскольку они не содержат все незаменимые аминокислоты. Для получения полноценных растительных белков необходимо изменить нуклеотидную последовательность их генов так, чтобы закодированные в них белки содержали все незаменимые аминокислоты. Полноценные растительные белки можно получить и другим способом. В этом случае в геном растения следует ввести гены других запасных белков. В результате в растении будут синтезироваться свои собственные и трансгенные запасные белки, которые в совокупности будут содержать все незаменимые аминокислоты.

Качество растительного масла зависит от содержания в его составе различных жирных кислот. При создании трансгенной сои в ее геном был введен ген десатуразы. В результате такого переноса ее собственный ген перестал экспрессироваться. Десатураза катализирует превращение одинарной связи между атомами углерода в двойную.

Подавление собственного гена десатуразы привело к тому, что содержание полиненасыщенных жирных (лино левой и ленноленовой) кислот в соевом масле снизилось, а содержание мононенасыщенной кислоты (олеиновой) возросло. Потребительские свойства соевого масла с таким жирнокислотным составом оказались выше, чем масла нетрансгенных сортов сои.

Получен трансгенный рапс с измененным составом растительного масла, содержащим до 45 % жирной кислоты (С12) лаурата. Это жирная кислота широко используется для производства стиральных порошков, шампуней, косметики. В геном трансгенного рапса был интегрирован ген тиоэстеразы из растения Umbellularia califomica. Выбор на это растение пал, потому что содержание лаурата в масле его семян достигает 70 %. Введение гена тиоэстеразы в геном рапса привело к увеличению содержания лаурата в составе и его масла.

С помощью трансгенных растений возможно полу чение крахмала с заданными свойствами. Крахмал состоит из двух компонентов амиилопектина и амилозы. Раствор амилопектина менее вязкий и более прозрачный, чем раствор амилозы, и его предпочтительнее использовать в пищевой промышленности. В связи с этим перспективно создание крахмалнакапливающих культур, синтезирующих преимущественно амилопектин.

Созревшие фрукты и овощи имеют более короткий срок хранения, чем несозревшие. С целью продления продолжительности хранения томатов были созданы трансгенные растения с замедленным сроком созревания.

Таким томатам был введен ген, кодирующий антисмысловую РНК полигалактуроназы, фермента, разрушающего пектин и способствующего созреванию томатов. Трансген подавлял синтез полигалактуроназы за счет образования дуплекса между антисмысловой РНК и иРНК фермента.

Ацетилен, активируя гены, ответственные за созревание, ускоряет этот процесс. Блокируя синтез ацетилена введением в томаты генов антисмысловых РНК ферментов, отвечающих за его (ацетилена) продукцию, были получены трансгенные растения с замедленным сроком созревания. Такие томаты были также получены в результате введения в их геном генов, ответственных за деградацию предшественника ацетилена.

Принципиальные подходы, используемые для созда ния трансгенных томатов с замедленным сроком созревания, можно распространить и на другие растения.

Методами генной инженерии можно улучшить внеш ний вид плодов, а также их вкус. Например, за счет введения генов сладких белков монеллина и тауматина. Земляника с геном тауматина оказалась более устойчива к болезням, чем нетрансгенная.

С помощью ДНК-технологий можно ввести гены, ответственные за азотфиксацию, в геном культурных растений и добиться их экспрессии. Тем самым решить проблему нехватки азотных удобрений. Манипуляции с ДНК могут привести к повышению эффективности фотосинтеза, и, следовательно, к увеличению биоорганической продукции.

Получены трансгенные растения, плоды которых яв ляются партенокарпическими, то есть сформировавши мися без опыления. Для партенокарпических плодов характерно либо полное отсутствие семян, либо наличие их незначительного количества.

Созданы трансгенные растения с измененными декора тивными свойствами. Например, петунии с разноцветными цветками или гвоздики с генами из других цветов, отвечающих за голубую и фиолетовую окраски. Получен генетически модифицированный рис, способный без ущерба провести под водой до двух недель.

Трансгенные растения «биореакторы»



Pages:     | 1 | 2 || 4 |
 




Похожие материалы:

«МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ САРАТОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ Н.И. ВАВИЛОВА АГРАРНАЯ НАУКА В XXI ВЕКЕ: ПРОБЛЕМЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ Сборник статей VIII Всероссийской научно-практической конференции САРАТОВ 2014 1 УДК 378:001.891 ББК 4 Аграрная наука в XXI веке: проблемы и перспективы: Сборник ста тей VIII Всероссийской научно-практической конференции. / ...»

«из ФОНДОВ РОССИЙСКОЙ ГОСУДАРСТВЕННОЙ БИБЛИОТЕКИ А5аев, Василий Васильевич 1. Параметры текнолозическозо процесса оБраБотки почвы дисковым почвооБраБатываютцим орудием 1.1. Российская государственная Библиотека diss.rsl.ru 2003 Л5аев, Василий Васильевич Параметры текнологического процесса о5ра5отки почвы дисковым почвоо5ра5атываю1цим орудием [Электронный ресурс]: Дис. . канд. теки, наук : 05.20.01 .-М.: РГЕ, 2003 (Из фондов Российской Государственной Библиотеки) Сельское козяйство — Меканизация ...»

«Министерство сельского хозяйства РФ Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Мичуринский государственный аграрный университет Б.И. Смагин, С.К. Неуймин Освоенность территории региона: теоретические и практические аспекты Мичуринск – наукоград РФ, 2007 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com УДК 332.122:338.43 ББК 65.04:65.32 С50 Рецензенты: доктор экономических наук, профессор И.А. Минаков доктор ...»

«УДК 634.42:631.445.124 (043.8) Инишева Л.И. Почвенно-экологическое обоснование комплексных мелиораций. – Томск: Изд-во Том. Ун-та, 1992, - 270с.300 экз. 3804000000 В монографии представлен подход к мелиоративному проектированию комплексных мелиораций с позиции генетического почвоведения. На примере пойменных почв южно- таежной подзоны в пределах Томской области рассматриваются преимущества данного подхода в мелиорации. Проведенные исследования на 4 экспериментальных мелиоративных системах в ...»

«МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Пермская государственная сельскохозяйственная академия имени академика Д.Н. Прянишникова И.А. Самофалова СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ КЛАССИФИКАЦИИ ПОЧВ Учебное пособие Допущено Учебно-методическим объединением вузов Российской Федерации по агрономическому образованию в качестве учебного пособия для подготовки магистров, обучающихся по направлению ...»

«Н. В. Гагина, Т. А. Федорцова МЕТОДЫ ГЕОЭКОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ Курс лекций МИНСК БГУ 2002 1 УДК 550.8 ББК 26.3 Г12 Р е ц е н з е н т ы: кафедра физической географии Белорусского государственного педагогического университета им. М. Танка; заведующий научно-исследовательской лабораторией экологии ландшафтов Белорусского государственного университета, доцент, кандидат сельскохозяйственных наук В. М. Яцухно; Печатается по решению Редакционно-издательского совета Белорусского государственного ...»

«У к р а и н с к а я академия аграрных наук Национальный научный центр И н с т и т у т почвоведения и а г р о х и м и и им. А . Н . С о к о л о в с к о г о В. В. Медведев Твердость почвы Х А Р Ь К О В - 2009 УДК 631.41 В.В.Медведев. Твердость почв. Харьков. Изд. КГ1 Городская типо- графия, 2009, 152 с. Книга написана с целью популяризации твердости почв и ее более ши рокого использования в почвоведении, земледелии и земледельческой меха нике. Рассмотрены факторы, влияющие на твердость, ...»

«МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ УЧРЕЖДЕНИЕ ОБРАЗОВАНИЯ ГРОДНЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ХV МЕЖДУНАРОДНАЯ НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ СОВРЕМЕННЫЕ ТЕХНОЛОГИИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОГО ПРОИЗВОДСТВА МАТЕРИАЛЫ КОНФЕРЕНЦИИ (Гродно, 27 апреля, 18 мая 2012 года) В ДВУХ ЧАСТЯХ ЧАСТЬ 2 ЭКОНОМИКА БУХГАЛТЕРСКИЙ УЧЕТ ТЕХНОЛОГИЯ ХРАНЕНИЯ И ПЕРЕРАБОТКИ ОБЩЕСТВЕННЫЕ НАУКИ Гродно ГГАУ 2012 УДК 631.17 (06) ББК М ХV М е ж д у н а р о д н а я ...»

«Министерство образования Республики Беларусь Учреждение образования Гомельский государственный университет имени Франциска Скорины Т. А. Колодий, П. В. Колодий ЛЕСОЭКСПЛУАТАЦИЯ Практическое руководство по подготовке и оформлению курсовых проектов для студентов специальности 1-75 01 01 Лесное хозяйство Гомель УО ГГУ им. Ф. Скорины 2010 УДК ББК К Рецензенты: технический инспектор труда Гомельского обкома профсоюза работников леса, С. П. Поздняков; доцент кафедры лесохозяйственных дисциплин ...»

«Е.В. Шеин КУРС ФИЗИКИ ПОЧВ Рекомендовано УМО по классическому университетскому образованию в качестве учебника для студентов высших учебных заведений, обучающихся по направлению 510700 Почвоведение и специальности 013000 Почвоведение ИЗДАТЕЛЬСТВО МОСКОВСКОГО УНИВЕРСИТЕТА 2005 УДК 631 ББК 40.3 Ш 39 Печатается по решению Ученого совета Московского университета Федеральная целевая программа Культура России на 2005 г. (подпрограмма Поддержка полиграфии и книгоиздания России) Рецензенты Заведующий ...»

«Раздел 1. КОРМЛЕНИЕ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ И ТЕХНОЛОГИЯ КОРМОВ УДК 636.4.084 СБАЛАНСИРОВАННОСТЬ РОССЫПНЫХ КОМБИКОРМОВ ДЛЯ СВИНОМАТОК А.А. ХОЧЕНКОВ РУП Научно-практический центр НАН Беларуси по животноводству г. Жодино, Минская обл., Республика Беларусь, 222160 (Поступила в редакцию 20.12.2009) Введение. Современная комбикормовая промышленность Беларуси для кормления свиноматок выпускает как россыпные, так и гранули рованные комбикорма. Обе формы комбикормов имеют свои достоин ства и ...»

«МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ АССОЦИАЦИЯ ИСПЫТАТЕЛЕЙ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ ТЕХНИКИ И ТЕХНОЛОГИЙ (АИСТ) СРАВНИТЕЛЬНЫЕ ИСПЫТАНИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ ТЕХНИКИ Москва 2013 УДК 631.3-048.24 ББК 40.72 С 75 Под общ. ред. председателя ассоциации испытателей сельскохозяйственной техники и технологий (АИСТ) В.М. Пронина Авторы: П.И. Бурак, В.М.Пронин, В.А.Прокопенко, А.А.Медведев, Т.Б. Микая, С.Н. Киселев, М.Н.Жердев, Г.А.Жидков, В.И.Масловский, В.В.Конюхов, Л.В.Колодин, ...»

«ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ ГОУ ВПО ВОЛГОГРАДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ВОЛЖСКИЙ ГУМАНИТАРНЫЙ ИНСТИТУТ (ФИЛИАЛ) ВОЛГУ А.С. Акишин, М.М. Подколзин, А.С. Акишин Земельные ресурсы России и Волгоградской области и формирование новой аг- ропродовольственной политики (2005—2012 годы) Учебное пособие ВОЛГОГРАДСКОЕ НАУЧНОЕ ИЗДАТЕЛЬСТВО 2008 338.43 УДКУДК ББК 65.32-51+65.281 А39 Научный редактор д-р с.-х. наук, проф. Л.И. Сергиенко [ВГИ (филиал) ВолГУ] Рецензенты: д-р экон. наук, проф. ...»

«И.Г. Крымская Гигиена и экология человека Соответствует Федеральному государственному образовательному стандарту (третьего поколения) Среднее профессиональное образование И. Г. К р ы м ск ая ГИ ГИ Е Н А И ЭКОЛОГИЯ ЧЕЛО ВЕКА Учебное пособие Рекомендовано Международной Академией науки и практической организации производства в качестве учебного пособия для студентов образовательных учреждений среднего профессионального образования Издание 2-е, стереотипное Ростов-на-Дону Феникс 2012 УДК ...»

«Вы – свет мира Евангелие от Матфея, глава 5, стих 14 И, зажегши свечу, не ставят ее под сосудом, но на подсвечнике, и светит всем в доме. Евангелие от Матфея, глава 5, стих 15 Книга издана при поддержке Благотворительного фонда “Під покровом Богородиці”. Вы – свет мира Очерки жизни Владимира Леонидовича Бандурова Запорожье 2013 УДК 63(477.64)(092)Бандуров В. Л. ББК 65.9(4 Укр–4 Зап 5 Пол)32-03д В 92 Вы – свет мира. Очерки жизни Владимира Леони В 92 довича Бандурова / Н. Кузьменко, В. Манжура, ...»

«Министерство сельского хозяйства Российской Федерации Министерство сельского хозяйства и продовольстия Свердловской области ФГБОУ ВПО Уральская государственная сельскохозяйственная академия XIII МЕЖДУНАРОДНАЯ НАУЧНО–ПРАКТИЧЕСКАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ СТУДЕНТОВ, АСПИРАНТОВ И МОЛОДЫХ УЧЕНЫХ МОЛОДЕЖЬ И НАУКА 2011 Участие молодых ученых в реализации Государственной программы развития сельского хозяйства и регулирования рынков сельскохозяйственной продукции, сырья и продовольствия на 2008–2012 годы ...»

«Министерство Природных Ресурсов Федеральная служба по надзору в сфере природопользования Государственный природный заповедник Полистовский УДК Утверждаю: Директор заповедника Регистрационный № _ Яблоков М.С. Инвентарный № __2009 г. Тема: Динамика явлений и процессов в природном комплексе заповедника ЛЕТОПИСЬ ПРИРОДЫ Книга 9 2008 год Стр. Ст. научный сотрудник Черевичко А.В. Карт. Фото Диагр. 30 мая 2009 г. СОДЕРЖАНИЕ Территория заповедника 1. Пробные и учётные площади, ключевые участки, ...»

«Министерство Природных Ресурсов Федеральная служба по надзору в сфере природопользования Государственный природный заповедник Полистовский УДК Утверждаю: Директор заповедника Регистрационный № _ Яблоков М.С. Инвентарный № __2008 г. Тема: Динамика явлений и процессов в природном комплексе заповедника ЛЕТОПИСЬ ПРИРОДЫ Книга 8 2007 год Стр. 124 Ст. научный сотр. Ларионова С.Ю. Карт. Фото Диагр. 2 12 декабря 2008 г. СОДЕРЖАНИЕ Территория заповедника 1. Пробные и учётные площади, ключевые участки, ...»

«Министерство Природных Ресурсов Федеральная служба по надзору в сфере природопользования Государственный природный заповедник Полистовский УДК Утверждаю: Директор заповедника Регистрационный № _ Яблоков М.С. Инвентарный № __2008 г. Тема: Динамика явлений и процессов в природном комплексе заповедника ЛЕТОПИСЬ ПРИРОДЫ Книга 7 2006 год Стр. 111 Ст. научный сотр. Ларионова С.Ю. Карт. Фото Диагр. 6 8 февраля 2008 г. СОДЕРЖАНИЕ Территория заповедника 1. Пробные и учётные площади, ключевые участки, ...»






 
© 2013 www.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.