WWW.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

«Министерство образования Республики Беларусь УЧРЕЖДЕНИЕ ОБРАЗОВАНИЯ «ГРОДНЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ ЯНКИ КУПАЛЫ» В.И. ...»

-- [ Страница 2 ] --

В результате расщепления образца ДНК опреде ленной рестриктазой всегда образуется один и тот же набор фрагментов. Различные рестриктазы, имеющие неодинаковые сайты узнавания, расщепляя один и тот же образец ДНК, будут образовывать наборы фрагментов, отличающиеся по размеру. Сравнение размеров фрагментов ДНК, полученных после обработки определенного образца ДНК несколькими рестриктазами (по отдельности и со Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии вместно), позволяет построить рестрикционную карту, на которой указано расположение каждого сайта рестрикции на исследуемой молекуле ДНК.

Рестриктазы используют для построения рестрик ционных карт. Рассмотрим, как это делается. Предположим, что ДНК, размер молекул которой составляет 3300 п.н., обработали по отдельности рестриктазой 1 и рестрикта зой 2 (рис. 4.3). В результате расщепления рестриктазой получили три фрагмента длиной 1 700, 1 000 и 600 п.н., а при расщеплении рестриктазой 2 получили также три фраг мента, но их длина соответственно составила 1 900, 1 200 и 200 п.н. При расщеплении этого же образца ДНК смесью рестриктаз 1 и 2 получили пять фрагментов, размеры которых соответственно равны 1 200, 800, 600, 500 и 200 п.н.

На основании установленных размеров фрагментов ДНК необходимо далее определить их очередность расположения в исследуемой молекуле ДНК и определить расположение сайтов рестрикции для рестриктазы 1 и рестриктазы 2.

Образование трех фрагментов при действии каждой из рестриктаз свидетельствует о том, что в исследуемой ДНК имеется по два сайта узнавания для каждой из рестрик таз. Образующийся в результате действия рестриктазы фрагмент размером 600 п.н. не расщепляется при гидролизе смесью обеих рестриктаз (рис. 4.3), следовательно, он не будет содержать сайт рестрикции для рестриктазы 2.

Фрагменты размером 1 700 и 1 000 п.н. расщепляются смесью рестриктаз, следовательно, каждый из них имеет по сайту узнавания для рестриктазы 2. При этом фрагмент размером 1 700 п.н. распадается на куски по 500 и 1 200 п.н., а фрагмент 1000 п.н. на куски по 200 и 800 п.н. (рис. 4.3). Образующийся в результате действия рестриктазы 2 фрагмент размером 1 900 п.н. при гидролизе смесью рестриктаз распадается (рис. 4.3) на три фрагмента (500+600+800 = 1 900), следовательно, он будет иметь два сайта узнавания для рестриктазы 1.

Соответствие между положением сайтов рестрикции и размером фрагментов, образующихся в результате действия рестриктаз (по отдельности и совместно), представлено на рестрикционной карте (рис. 4.3).

Рис. 4.3. Построение рестрикционной карты. Р1 – рестриктаза 1, На практике при построении рестрикционных карт могут быть применены и другие подходы. Например, может быть использовано более двух рестриктаз, в этом случае этот процесс становится довольно непростой процедурой. Также может быть осуществлено неполное расщепление ДНК Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии рестриктазами, что в определенной степени может упростить решение поставленной задачи. Еще один прием, который используется при составлении карт рестрикции – введение радиоактивной концевой метки. В этом случае определяют размеры полученных в результате рестрикции меченых фрагментов. Кроме того, перекрывающиеся фрагменты могут быть установены благодаря способности комплементарных последовательностей ДНК гибридизоваться.

Рестрикционные карты нашли широкое применение в молекулярной биологии и генетической инженерии.

Сравнение карт рестрикции родственных генов позволяет оценить степень гомологии между ними. Идентичность рестрикционных карт свидетельствует о высокой сте пени гомологии или может быть об идентичности исследуемых генов. Напротив, различие рестрикцион ных карт родственных генов позволяет предположить наличие значительных отличий в их нуклеотидных по следовательностях.

Поскольку рестрикционная карта отражает распо ложение определенных нуклеотидных последовательнос тей в образце ДНК, она может быть использована для определения первичной структуры данной ДНК. С этой целью вначале исследуемая ДНК разрезается с помощью рестриктаз. Затем полученные ее фрагменты разделяются с помощью электрофореза. Далее определяется первичная структура каждого фрагмента. На заключительном этапе, ис пользуя рестрикционную карту, расшифрованные нуклео тидные последовательности фрагментов располагают в очередности в соответствии с картой рестрикции. И так первичная структура ДНК определена.

Ферменты, синтезирующие ДНК Широко в генной инженерии используется ДНК полимераза I E. coli (Pol I). Этот фермент обладает тремя активностями: полимеразной и 5’3’- и 3’5’-эк зонуклеазными активностями. Благодаря полимеразной активности ДНК-полимераза I способна заполнять бреши в ДНК и превращать липкие концы в тупые (рис. 4.4).

Рис. 4.4. ДНК-полимераза I способна заполнять бреши в ДНК (А) В результате совместного действия полимеразной и 5’3’- экзонуклеазной активностей ДНК-полимеразы I в присутствии a-32Р-меченых дНТФ одноцепочечный раз рыв в одной из цепей ДНК способен перемещаться вдоль ДНК, при этом синтезируется радиоактивно меченая ДНК (рис. 4.5). Этот процесс называется ник-трансляция.

Рис. 4.5. В результате совместного действия полимеразной и 5’ 3’ экзонуклеазной активностей ДНК-полимеразы I в присутствии a-32Р-меченых дНТФ одноцепочечный разрыв в одной из цепей ДНК способен перемещаться вдоль ДНК, при этом синтезируется радиоактивно меченая ДНК Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии ДНК-полимераза 1 состоит из одной полипептидной цепи, которая образует три домена. N-концевой домен легко отделяется с помощью протеолитических ферментов.

Оставшаяся часть получила название (по фамилии одного из авторов, описавших ее) – фрагмент Кленова (Pol IK).

Последний обладает полимеразной и 3’ 5’-экзонуклеазной активностями. Фрагмент Кленова обычно используют для достройки одноцепочечных 5’-концов до тупых, для синтеза второй цепи на одноцепочечной ДНК и для гидролиза одноцепочечных 3’-концов на двухцепочечных молекулах ДНК.

При проведении ПЦР используются термостабильные ДНК-полимеразы: Tag ДНК-полимераза и Vent ДНК-поли мераза.

Обратная транскриптаза (ревертаза) обладает ДНК полимеразной активностью, использующей в качестве матрицы как РНК, так и ДНК, и активностью РНКазы Н, гидролизующей РНК в составе гибрида РНК – ДНК.

Для инициации синтеза ревертазе необходима затравка (праймер). Роль праймера может выполнять как РНК, так и ДНК.

Ревертазу главным образом используют для обратной транскрипции иРНК (рис. 4.6) в комплементарную ДНК (кДНК). В качестве затравки при обратной транскрипции иРНК, содержащих на 3’-конце полиА-последовательность, используют поли-дT-последовательность. После синтеза це пи ДНК комплементарной иРНК образуется гибрид ДНК РНК. РНК в составе гибрида разрушают. Обычно для этой цели применяют щелочь. Далее осуществляют синтез второй цепи ДНК. В качестве матрицы при ее синтезе выступает первая цепь кДНК. В этом случае используют способность ревертазы образовывать на 3’-концах одноцепочечных кДНК шпильку, которая выполняет функцию праймера.

Синтез второй цепи может катализировать как обратная транскриптаза, так и ДНК-полимераза I E.coli. По окончании синтеза цепи кДНК остаются ковалентно связанными. Петлю, связывающую цепи, разрезают с помощью эндонуклеазы S1, специфически гидролизующей одноцепочечные последовательности. Концы ДНК, образующиеся при расщеплении, могут оказаться выступающими. Превратить их в тупые можно с помощью фрагмента Кленова ДНК полимеразы I E.coli. Полученную кДНК можно использовать для дальнейших исследований.

Рис. 4.6. Синтез кДНК с использованием ревертазы Ферменты, лигирующие фрагменты ДНК ДНК-лигазы катализируют образование фосфо диэфирных связей между 5’-фосфатной и 3’-гидроксильной группами соседних дезоксинуклеотидов. В генетической ин женерии и молекулярной биологии часто используются ДНК-лигаза фага Т4. Этот фермент способен катализировать Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии лигирование одноцепочечных разрывов, липких концов и двухцепочечных фрагментов ДНК с тупыми концами (рис. 4.7).

Рис. 4.7. ДНК-лигаза фага Т4 катализирует лигирование одноцепочечных разрывов (А), липких концов (Б) двухцепочечных фрагментов ДНК с тупыми Терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза не нуждается в матрице, но требует затравку для своей работы. Этот фермент катализирует присоединение дезоксинуклеотидов к 3’-концу ДНК. При использовании в качестве субстрата одного типа дезоксинуклеотидов образуются молекулы ДНК, имеющие гомополимерные 3’-концы.

Терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза мо жет быть использована для конструирования липких концов в молекулах ДНК с целью их объединения (рис. 4.8). С этой целью образец ДНК инкубируют с ферментом в присутствии одного дезоксинуклеотида (например, дТТФ). В результате в молекуле ДНК на 3’-концах образуются поли-дТ-последовательности.

Другой образец ДНК инкубируют с ферментом в присутствии комплементарного дезоксинуклеотида (дАТФ).

В этом случае на 3’-концах образуются комплементарные поли-дА-последовательности. Смешивание таких молекул ДНК при определенных условиях приведет к образованию за счет липких концов гибридных молекул ДНК (рис. 4.8).

При гибридизации липких концов возможно образование брешей. Для их ликвидации применяют ДНК-полимеразы (рис. 4.8). Оставшиеся разрывы в цепях ДНК сшивают при помощи ДНК-лигазы (рис. 4.8).

Рис. 4.8. Объединение молекул ДНК с помощью терминальной Терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза может использоваться для введения в 3’-концы ДНК радиоактив ной метки в составе меченых дезоксинуклеотидов.

ПолиА-полимераза использует в качестве суб страта АТФ (но не другие НТФ и дАТФ), катализирует присоединение к 3’- концу одноцепочечных молекул РНК полиА-последовательностей (рис. 4.9). Применяется для присоединения полиА-последовательности к РНК при подготовке их молекул к копированию с помощью ревертазы Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии с целью получение кДНК. ПолиА-полимераза применяется также для введения в 3’-конец РНК радиоактивной метки.

Рис. 4.9. ПолиА-полимераза катализирует присоединение к 3’-концу РНК полиА-последовательности Фосфатазы (фосфомоноэстеразы) катализируют гид ролитическое расщепление 5’- фосфомоноэфиров или 3’- фосфомоноэфиров.

Фосфатаза используется для удаления 5’-концевого фосфата с целью предотвращения лигирования двух соседних дезоксинуклеотидов с помощью ДНК-лигазы.

Последняя, как указано выше, может катализировать обра зование фосфодиэфирных связей меж-ду 5’-фосфатной и 3’-гидроксильной группами, но не между 5’- и 3’-гид роксильными группами.

Полинуклеотидкиназа катализирует фосфорилирова ние 5’-концевых (но не 3’-концевых) гидроксильных групп ДНК и РНК. Этот фермент используется для мечения 5’- конца полинуклеотидной цепи с помощью радиоактив ного Р-32 в составе АТФ:

Введение меченого фосфата осуществляют после удаления немеченого 5’-фосфата с помощью фосфатазы.

Методы в генетической инженерии Гены для генно-инженерных экспериментов могут быть получены в результате их синтеза или выделены из природных источников. Синтез гена может быть осуществлен химическим способом или с помощью ПЦР. Эти подходы рассмотрены в главе «Синтез ДНК». Химический синтез гена возможен при условии, что известна его первичная структура или первичная структура полипептида, закодированного в нем. Для осуществления синтеза гена с использованием ПЦР требуется в качестве матрицы наличие самого гена и праймеров, комплементарных к его флангам. Кроме того, возможен синтез гена с помощью обратной транскриптазы на матрице иРНК, выделенной из клеток. Синтезирован ная таким образом ДНК будет отличаться от реального гена отсутствием регуляторных последовательностей и интронов.

Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии Ген может быть выделен из библиотеки генома. Прежде чем выделить ген из библиотеки генома, необходимо ее создать. Далее рассмотрим, каким образом создается библиотека генома (рис. 4.10). Вначале очищенную ДНК, выделенную из какого-либо организма, фрагментируют обычно с помощью рестриктаз. Далее фрагменты ДНК встраивают в вектор, например, плазмиду. Полученные химерные векторы вводят в бактериальные клетки. Затем клетки высевают на питательную среду и получают колонии, каждая из которых представляет собой клон, клетки которого являются потомками одной клетки. Все клетки одного клона имеют рекомбинантные плазмиды с идентичными фрагментами встроенной чужеродной ДНК. Совокупность клонированных фрагментов и называют библиотекой генома. При создании библиотеки генома с вероятностью 99 % попадания в нее всей ДНК необходимо получить число клонов для E.coli – 1 500, дрожжей – 4 600, дрозофил – 48 000, млекопитающих – 800 000. Такие библиотеки созданы. При создании библиотеки генома могут быть использованы и вирусные векторы.

Рис. 4.10. Схема получения библиотеки генома Из библиотеки генома можно выделить искомый ген. В этом случае поступают следующим образом (рис. 4.11). На чашки Петри с клонами бактерий, содержащие определенные фрагменты чужеродной ДНК, накладывается нитроцеллю лозный фильтр. В результате на фильтре получается слепок колоний. Затем осуществляют лизис клеток, денатурацию и фиксацию ДНК на фильтре. Далее проводят гибридизацию с зондом, комплементарным искомому гену. После анализа результатов гибридизации выявляют колонии, содержащие рекомбинантную плазмиду с искомым геном. Клетки этой колонии отбирают и культивируют в питательной среде с целью увеличения их биомассы. Затем из бактериальных клеток выделяют рекомбинантную плазмиду, и из нее вырезают искомый ген с помощью той рестриктазы, кото рую использовали для получения библиотеки генома.

Недостатком использования библиотек генома для выделения генов является то, что в результате дробления ДНК образуется огромное число фрагментов, и для их кло нирования необходимо использовать большое количество клонов. Последнее обстоятельство затрудняет поиск нужного фрагмента ДНК в библиотеке. Кроме того, фрагменты ДНК обычно не полностью соответствуют искомому гену. Фрагмент может содержать нуклеотидные последовательности, не входящие в состав гена. А также, поскольку разрезание ДНК носит случайный характер, фрагменты могут содержать только часть гена.

Рис. 4.11. Выделение гена из библиотеки генома. 1 – перенос колоний на фильтр, 2 – лизис клеток, денатурация ДНК и ее фиксация на фильтре, 3 – гибридизация ДНК с зондом и выявление результата гибридизации, 4 – культивирование клеток, содержащих рекомбинантную плазмиду с искомым геном, 5 – выделение рекомбинантной плазмиды из культуры клеток, 6 – вырезание с помощью рестриктазы из рекомбинантной Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии Кроме библиотеки генома может быть создана биб лиотека кДНК (рис. 4.12). При создании такой библиотеки необходимо из клеток живого организма выделить содер жащиеся в них иРНК. Потом при использовании их в качестве матрицы с помощью ревертазы осуществляют синтез кДНК.

Затем кДНК встраивают в плазмиды и рекомбинантные плазмиды вводят в бактериальные клетки. Далее, размно жая клетки, получают клоны бактерий, содержащих реком бинантные плазмиды со строго определенной кДНК. Поиск и выделение кДНК из библиотеки кДНК осуществляют ана логичным образом, как и в случае с библиотекой генома.

Преимущество библиотеки кДНК перед библио текой генома заключается в том, что нуклеотидные после довательности кДНК полностью соответствуют кодирующим последовательностям гена. кДНК в отличие от реального гена не содержит интроны, поэтому ее можно использовать в генетической инженерии прокариот. Последние не способны осуществлять сплайсинг эукариотических РНК.

Рис. 4.12. Схема получения библиотеки кДНК Определенный ген можно выделить из геномной ДНК.

С этой целью вначале из клеток организма выделяют ДНК.

Затем ее подвергают рестрикционному расщеплению. Полу ченные фрагменты подвергают электрофоретическому разделению в агарозном геле. После электрофореза на гель накладывают мембрану. В результате на ней обра зуется слепок, на котором фрагменты ДНК занимают те же положения, что и на электрофореграмме. Затем мембрану обрабатывают радиоактивно меченым зондом, комплементарным искомому гену. После гибридизации зонда на мембрану накладывают рентгеновскую пленку.

После экспозиции на пленке проявляются засвеченные места, соответствующие расположению фрагмента ДНК, комплементарному зонду. Данный метод полу чил название Саузерн-блоттинг в честь ученого, разра ботавшего его – Э.Саузерна. По расположению полосы гибридизации на фильтре устанавливают нахождение на электрофореграмме фрагмента ДНК, содержащего искомый ген. Извлекают его из геля и затем используют в дальнейших экспериментах.

Введение гена в вектор и получение Под вектором понимают небольшую молекулу ДНК, способную автономно реплицироваться и обеспечивать размножение и функционирование встроенных в них генов.

Вектор должен обладать следующими характе ристиками:

• иметь точку начала репликации (ori) и автономно реплицироваться;

• содержаться в многочисленных копиях в клетке хозяине;

• сохраняться в дочерних клетках при делении мате ринской;

• обладать достаточной емкостью, позволяющей встраивать в них гены;

• содержать сайты рестрикции, используемые для встраивания гена в вектор;

• иметь маркеры, позволяющие осуществлять отбор клеток, содержащих рекомбинантный вектор.

Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии Для доставки чужеродных генов в клетки используют векторы, созданные на основе плазмид, вирусов и др. С этой целью в структуру вектора интегрируют чужеродную ДНК. Вектор, содержащий чужеродный ген, называется рембинантный или химерный вектор. Существует несколько способов введения генов в вектор. Рассмотрим их.

Рекомбинантный вектор можно получить с исполь зованием рестриктаз (рис. 4.13). В этом случае вектор и чужеродную ДНК, из которой получают ДНК-вставку, встраиваемую в вектор, разрезают с помощью одной и той же рестриктазы. В результате этого образовавшиеся липкие концы вектора и ДНК-вставки оказываются комп лементарными. При их смешивании в присутствии ДНК лигазы происходит объединение вектора и ДНК-вставки с образованием рекомбинантного вектора.

Рис. 4.13. Получение рекомбинантного вектора на основе плазмиды Помимо образования рекомбинантного вектора воз можно внутримолекулярное лигирование вектора и ДНК вставки. В результате этого может произойти восстановление структуры исходного вектора или замыкание в кольцо ДНК вставки. Для увеличения выхода рекомбинантного вектора его после рестрикции обрабатывают фосфатазой с целью удаления 5’-фосфомоноэфирных групп. При отсутствии последних ДНК-лигаза не может осуществлять лигирование, поскольку для образования фосфодиэфирных связей необходимо наличие 5’-фосфатной и 3’-гидроксильной групп соседних нуклеотидов. Таким образом, после обработки фосфатазой становится невозможным восстановление исходной структуры вектора, что приводит к увеличению выхода рекомбинантного вектора.

Рекомбинантные векторы могут быть получены после их разрезания с образованием тупых концов и последующим лигированием с помощью ДНК-лигазы фага Т4 с чужеродной ДНК по тупым концам (рис. 4.14).

Рис. 4.14. Получение рекомбинантного вектора на основе плазмид с использованием ДНК-лигазы фага Т4, сшивающей ДНК по тупым концам Для создания рекомбинантного вектора может быть использована терминальная дезоксинуклеотидилтранс фераза. С ее участием можно нарастить липкие концы, с помощью которых можно объединить молекулы ДНК. Особенности этого подхода описаны выше в теме «Терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза» и пред ставлены на рис. 4.8 и 4.15.

Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии Рис. 4.15. Получение рекомбинантного вектора с использованием терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы Плазмиды представляют собой автономно репли цирующиеся внехромосомные обычно кольцевые двух цепочечные молекулы ДНК. Природные плазмиды могут быть использованы в качестве вектора для переноса чужеродной ДНК. Однако они не всегда высокоэффективны.

В связи с этим для достижения высокой эффективности функционирования плазмидные векторы создаются с помощью методов генетической инженерии. Плазмидные векторы должны:

• иметь небольшой размер, с увеличением размера вектора снижается размер встраиваемой в него чужеродной ДНК;

• иметь в своем составе сайт рестрикции, по которому может быть осуществлено встраивание чужеродной ДНК;

• иметь в своем составе селективные маркеры, не обходимые для идентификации клеток, захвативших рекомбинантную ДНК.

В настоящее время сконструировано множество плаз мидных векторов, используемых в генетической инженерии.

Широкое применение нашел плазмидный вектор pBR (p – от англ. plasmid, BR – инициалы создателей – Ф.Боливара и Р.Радригиса, 322 – число, взятое из исследовательских протоколов). Его размер составляет 4361 п.н. Эта плазмида (рис. 4.16) несет ori, обеспечивающий репликацию плазмиды только в клетках E.coli, два селективных маркера – гены устойчивости к антибиотикам ампициллину и тетрацикли ну, по одному сайту рестрикции для нескольких рестриктаз (среди них в гене устойчивости к тетрациклину для Hind III, BamH I и Sal I, а в гене устойчивости к ампициллину – для Pvu I и Pst I). Плазмида в клетках может реплицироваться с образованием большого числа копий, что обеспечивает присутствие в бактериальной клетке чужеродной ДНК в составе рекомбинантной pBR322 также в большом числе копий.

Рис. 4.16. Плазмида pBR322. ГУТ – ген устойчивости к тетрациклину, ГУА – ген устойчивости к ампициллину. Указаны сайты узнавания для Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии Клетки E.coli, содержащие pBR322, способны расти в среде, содержащей как ампициллин, так и тетрациклин, или оба эти антибиотика. Напротив, бактериальные клет ки, в которых данная плазмида отсутствует, не растут в среде, содержащей любой из этих антибиотиков или оба антибиотика.

В то же время бактериальные клетки, содержащие плазмиду, в области гена устойчивости к тетрациклину которой осуществлена вставка чужеродной ДНК, будут устойчивы к ампициллину, но не будут расти в присутствии тетрациклина (рис. 4.17). Если же ввести чужеродную ДНК в состав гена устойчивости к ампициллину, то наблю дается обратная картина (рис. 4.17). Таким образом, чув ствительность клеток E.coli к указанным антибиотикам позволяет идентифицировать в них наличие или отсутствие рекомбинантной или интактной pBR322.

Рис. 4.17. Вставка чужеродной ДНК в область генов устойчивости к антибиотикам плазмиды pBR322 влияет на чувствительность бактериальных клеток к соответствующим антибиотикам. ГУТ – ген устойчивости к тетра циклину, ГУА – ген устойчивости к ампициллину Находят свое применение плазмидные векторы, содержащие в своем составе в качестве селективного мар кера ген lac-Z, кодирующего фермент -галактозидазу.

Этот фермент катализирует расщепление субстрата X-gal с образованием окрашенного в голубой цвет продукта. В качестве примера рассмотрим организацию вектора pUC (рис. 4.18). Эта плазмида имеет размер 27 000 п.н. и содержит в своем составе помимо гена lac-Z, ген устойчивости к ампициллину. В гене lac-Z расположен участок, называемый полилинкер, в котором находятся сайты узнавания для рестриктаз. Именно в него осуществляют вставку чужеродной ДНК. В результате такой вставки нарушается организация гена lac-Z и он теряет способность экспрессироваться с образованием функционально активной -галактозидазы.

Рис. 4.18. Плазмида pUC 18. ГУА – ген устойчивости к ампициллину Бактериальные клетки, содержащие как реком бинантный со вставкой чужеродной ДНК, так и нерекомбинантный векторы pUC 18, в отличие от бес плазмидных клеток способны расти в среде с ампициллином.

При этом колонии клеток с нерекомбинантном вектором окрашены в голубой цвет, а колонии с рекомбинантной плазмидой будут белыми (рис. 4.19). Так селективные маркеры позволяют идентифицировать наличие вектора в бактериальных клетках.

Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии Рис. 4.19. Вставка чужеродной ДНК в область гена lac-Z плазмиды pUC нарушает его экспрессию. ГУА – ген устойчивости к ампициллину Фаговые векторы предпочтительнее использовать, чем плазмидные векторы, при клонировании более крупных фрагментов чужеродной ДНК. Наиболее распространен ными фаговыми векторами для E.coli являются векторы, созданные на основе фагов и М13.

Для фага характерно два альтернативных пути раз вития: литический и лизогенный. В случае литического пути развития после проникновения фага в клетку его гены начинают экспрессироваться в определенной последовательности. Результатом их экспрессии является образование порядка 100 фаговых частиц на клетку. Затем происходит лизис клетки и фаговые частицы оказываются в окружающей среде. При лизогенном пути развития ДНК фага встраивается в ДНК бактерии и реплицируется вместе с ней. Спонтанно или под действием каких-либо факторов фаг может перейти на литический путь развития.

Геном фага может быть представлен множественными формами (рис. 4.20). Внутри фаговой частицы геном фага находится в линейной форме. При попадании фага в клетку, его ДНК замыкается в кольцо за счет липких концов. Во время репликации ДНК фага образует длинные конкатемеры, которые затем разрезаются на индивидуальные геномные ДНК фага. И четвертая форма – интегрированная форма ДНК фага в клеточном геноме.

Рис. 4.20. Геном фага может быть представлен линейной (1), кольцевой (2), конкатемерной (3) и интегрированной (4) в клеточный геном формами Геном фага полностью расшифрован и его размер составляет 48502 п.н. (рис. 4.21). ДНК фага содержит область начала репликации (ori), гены структурных белков, участвующих в формировании вирусной частицы, гены ферментов, принимающих участие в репликации, гены, обеспечивающие лизис инфицированных клеток, и гены, ответственные за установление лизогении. Около 1/3 части генома между точками 20 – 38 т.п.н. являются не обязательной для установления литической инфекции. В этом участке генома представлены гены, необходимые для установления лизогенного состояния. Несущественной является также область ДНК вблизи точки 43 т.п.н. При конструировании векторов на основе ДНК фага, все гены или часть генов, необходимых для лизогении, удаляются.

Поэтому инфицирование всегда сопровождаются лизисом клеток. Для успешной упаковки ДНК фага в вирионе ее длина должна составлять 38 – 52 т.п.н. В связи с этим все Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии удаленные последовательности ДНК при конструировании рекомбинантного вектора могут быть заменены сегментом чужеродной ДНК соответствующей длины.

Рис. 4.21. Линейный геном фага. Необязательные для литической инфекции На основе фага создано множество -векторов. Эти векторы подобно фагу могут размножаться посредством литической инфекции. Наличие сайтов рестрикции в их геноме позволяет осуществить удаление несуществен ной области и обеспечить встраивание чужеродной ДНК (рис. 4.22). Размер встраиваемого фрагмента может составлять до 24 т.п.н.

Рис. 4.22. Схема встраивания чужеродной ДНК в l-вектор. СР – сайт рестрикции Некоторые -векторы содержат ген -галактозидазы.

При создании рекомбинантного -вектора вместе с несу щественной областью удаляется и ген -галактозидазы. При инфицировании бактериальных клеток, выращиваемых на среде с X-gal, нерекомбинантным -вектором, на их колониях будут формироваться голубые бляшки. При инфицировании же бактериальных клеток рекомбинантным -вектором – будут формироваться бесцветные бляшки. Так можно различить рекомбинантный и нерекомбинантный -векторы.

Широкое применение в генетической инженерии нашли векторы, сконструированные на основе фага М13.

Геном фага представлен кольцевой одноцепочечной ДНК, размер которой составляет около 6 400 нуклеотидов.

После инфицирования клеток E.coli одноцепочечная ДНК превращается в двухцепочечную кольцевую форму. Затем происходит репликация таких молекул с образованием приблизительно 300 копий, которые впоследствии исполь зуются в качестве матриц для синтеза одноцепочечных фаговых ДНК. Одновременно с синтезом ДНК происходит экспрессия фаговых генов. Одноцепочечные фаговые ДНК совместно с белками капсида формируют зрелые фаговые частицы, которые покидают клетки, образуя на бактериальной колонии мутные бляшки. Бактериальные клетки при этом не погибают, хотя их рост замедляется.

При создании рекомбинантной ДНК используют двухцепочные репликативные формы ДНК фага М13. Од ноцепочечные же ДНК фага не применяются в качестве векторов, поскольку не могут быть разрезаны с помощью рестриктаз.

В геноме фага М13 имеется некодирующая область, длина которой составляет 507 нуклеотидов. В этот сайт может быть встроена вставка, не приводящая к нарушению репликации ДНК фага. Часто в эту область при создании векторов встраивают фрагмент lac-оперона E.coli, содержа щий часть гена -галактозидазы, и так называемый полилин кер (рис. 4.23). Полилинкер содержит сайты узнавания для нескольких рестриктаз. Именно в полилинкер при создании Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии рекомбинантного вектора встраивают чужеродную ДНК. В отсутствии в составе полилинкера вставки чужеродной ДНК векторный геном детерминирует синтез -галактозидазы.

При наличии в среде субстрата Xgal, бляшки окрашиваются в голубой цвет. При наличии же вставки чужеродной ДНК в составе полилинкера синтез -галактозидазы нарушается и формируются бесцветные бляшки (рис. 4.23). Таким образом, можно различить бляшки, содержащие рекомбинантный и нерекомбинантный векторы.

Рис. 4.23. Схема получения рекомбинантного вектора на основе фага М13.

1 – введение в некодирующую область генома фага фрагмента lac-оперона E.coli, содержащего часть гена -галактозидазы, и так называемый полилинкер.

2 – введение в область полилинкера чужеродной ДНК Космиды являются гибридными векторами, состоящи ми из плазмидной ДНК и фрагментов ДНК фага (рис. 4.24).

Плазмидная составляющая содержит уникальные сайты рестрикции и селективные маркеры, а фаговая – соединенные липкие концы (cos-сайт). Космиды реплицируются по плазмидному типу репликации и способны упаковываться в оболочки фага. В состав космидного вектора может быть включена вставка чужеродной ДНК до 45 т.п.н.

Клонирование чужеродной ДНК при использовании космид осуществляют следующим образом (рис. 4.25). Вна чале космиду разрезают с помощью рестриктазы. Далее линейную космиду смешивают с чужеродной ДНК, липкие концы которой комплементарны липким концам космиды.

После отжига и лигирования образуются конкатемеры.

Обработка конкатемеров белками, осуществляющими упаковку ДНК фага, приводит к вырезанию из конкатемеров по cos-сайтам фагового генома, содержащего ДНК-вставку. Наличие cos-сайтов является единственным необходимым требованием для упаковки ДНК в фаговые частицы. Таким образом, последовательность нуклеотидов ДНК, расположенная между двумя cos-сайтами, может быть упакована в фаговые частицы. Фаговая частица, содержащая между cos-сайтами только чужеродную ДНК, будет нежизнеспособной. В то же время после адсорбции такой фаговой частицы на поверхности клетки, заключен ная в ней ДНК поступает внутрь бактерии, где она начинает реплицироваться как плазмида. Поскольку плазмида (космида) содержит в своем составе селективные маркеры – генов устойчивости к антибиотикам – бактериальные клетки выращивают на среде с соответствующими антибиотиками.

С одной стороны, наличие плазмиды обеспечивает выжи вание бактериальных клеток, а выращивание бактерий на среде с антибиотиками, с другой стороны, – обеспечивает сохранение таких плазмид в клетках.

Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии Упаковка ДНК космид в фаговые частицы необходима только для облегчения процесса введения рекомбинантных ДНК большого размера внутрь бактериальных клеток.

Проникшая внутрь клетки рекомбинантная космида может в ней существовать как плазмида и не может быть упакована в фаговую частицу.

Рис. 4.25. Схема клонирования чужеродной ДНК при использовании космид Фазмиды, также как и космиды, являются гибридами плазмид и фага, однако в отличие от космид, в них сохранены функции репликации как плазмиды, так и фага.

Фазмиды представляют собой линейные молекулы ДНК, на концах которой находятся сегменты ДНК фага, содержащие гены, необходимые для литической инфекции, а в центральной части – плазмидный сегмент, обычно сос тоящий из нескольких повторов последовательностей плазмидной ДНК. В процессе получения рекомбинантной фазмиды, один или несколько повторов плазмидной ДНК заменяется чужеродной ДНК. Попадая в клетку, фазмида в зависимости от ее конструкции и от условий выращи вания бактерий может реплицироваться либо как фаговая ДНК, либо как плазмида. Таким образом, фазмиды в одних условиях могут размножаться как плазмиды, а в других – как фаги. Размножение фазмиды как фага, заканчивается лизисом клеток и выходом фаговых частиц из клетки.

Особенностью челночных векторов является способ ность их реплицироваться в двух разных видах организмов.

Такие векторы содержат две области начала репликации, соответствующие каждому из обоих видов хозяев. Существу ют челночные векторы, способные существовать как в клетках двух видов прокариот, так и в клетках прокариот (обычно в E.coli) и эукариот (дрожжи, растения, животные).

Векторы, используемые для введения чужеродной ДНК в клетки животных Для введения чужеродной ДНК в клетки животных часто используют векторы, сконструированные на основе вирусов. Широкое применение нашли векторы, созданные на основе SV40. Геном этого вируса представлен кольцевой двухцепочечной ДНК, размер которой составляет 5243 пн.

В геноме имеется ori и закодировано 5 белков: малый Т антиген, большой Т антиген и три белка капсида VP1, VP и VP3. Большой Т антиген необходим для репликации ДНК Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии вируса. В инфицированной клетке образуется около 100 000 вирусных частиц, которые покидая клетку, вы зывают её гибель. При создании векторов на основе SV40 удаляют определенные нуклеотидные последо вательности ДНК-вируса и вместо них в геном встраивают другие фрагменты ДНК.

Существуют три типа векторов, созданных на основе SV40:

•трансдуцирующие SV40-векторы. Такие векторы способны реплицироваться в клетках-хозяинах и упако вываться в вирионы. При их создании осуществляют замену кодирующих последовательностей ДНК вируса на фрагмент чужеродной ДНК эквивалентного размера.

В результате такой замены вектор теряет способность формировать вирусные частицы, из-за утраты способности обеспечивать синтез белка(ов), ген(ы) которого(ых) был(и) удалены из генома. Компенсировать утраченный синтез белка(ов) может вирус-помощник дикого типа. Последний, находясь в клетке совместно с трансдуцирующим вектором, способен обеспечить синтез всех белков, необходимых для удовлетворения как своих потребностей, так и потребностей трансдуцирующего SV-вектора. Таким образом, в присут ствии вируса-помощника трансдуцирующий вектор будет упакован в вирион;

• плазмидные SV40-векторы. В их составе присутству ет ori и ген большого Т антигена, в то же время гены белков капсида VP1, VP2 и VP3 отсутствуют. В связи с этим плазмидные векторы способны реплицироваться, но не упаковываться в вирионы. Плазмидные векторы могут быть челночными и содержать последовательности ДНК, позволяющие им реплицироваться как в клетках прока риот, так и клетках эукариот;

• пассивные трансформирующие векторы. Они не спо собны ни реплицироваться, ни упаковываться в вирионы.

Такие векторы представляют собой молекулы ДНК, которые содержат сегменты генома SV40, ответственные за экспрес сию генов. Пассивные векторы способны осуществить доставку чужеродной ДНК и внедрить ее в клеточную ДНК.

Широкое применение в генетической инженерии наш ли векторы, созданные на основе ретровируса. Геномной НК ретровирусов является РНК. Их жизненный цикл следующий. После адсорбции вириона на поверхности клетки и проникновения в нее происходит копирование РНК в результате обратной транскрипции с образованием двухцепочечной ДНК, которая затем интегрирует в клеточный геном. Интегрированная ДНК транскрибируется с образованием геномных и субгеномных РНК. Оба типа РНК служат матрицами для синтеза белка. После накопления вирус-специфических белков происходит формирование вирусных частиц и высвобождение их из клетки (рис. 4.26).

Рис. 4.26. Жизненный цикл ретровирусов При конструировании векторов на основе ретровирусов обычно часть ретровирусных генов удаляют. При этом опре деленные нуклеотидные последовательности, необходимые для обратной транскрипции, экспрессии генов, упаковки генома в вирионы должны быть сохранены. При получении рекомбинантного ретровирусного вектора чужеродные Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии нуклеотидные последовательности встраивают, замещая удаленные области генома. Далее рекомбинантный вектор с помощью различных ухищрений упаковывается в вирион, который способен обеспечить доставку генетического материала в клетку и его интеграцию в клеточный геном.

Таким образом, векторы, созданные на основе ретровирусов, способны не только доставлять чужеродный генетический материал в клетку, но и интегрировать его в ДНК клетки хозяина. Интегрированная чужеродная ДНК будет ре плицироваться вместе с клеточной ДНК, и передаваться при делении материнской клетки потомкам.

Векторы, используемые для введения чужеродной ДНК в клетки растений В генетической инженерии растений для транс формации растительных клеток используют векторы, созданные на основе вирусов. Например, вируса мозаики цветной капусты и др. Преимущество вирусов, используемых в качестве векторов, заключаются в том, что они легко проникают в клетку и в ней размножаются. При этом число копий вирусного генома в клетке может достигать десятков тысяч. Следовательно, число копий чужеродного гена в клетке достигает такого же значения. Наличие большого числа копий генов может обеспечить сверхсинтез белкового продукта. К недостаткам вирусных векторов относится огра ниченный размер вводимых в них чужеродной ДНК и то, что вирусы имеют ограниченный круг хозяев.

В настоящее время считается, что для доставки генетического материала в растительные клетки наиболее перспективно применение векторов, сконструированных на основе Ti- плазмиды Agrobackteria tumefaciens. Эти почвенные бактерии способны вызывать образование опухолей (ко рончатых галлов) у растений. Клетки корончатых галлов так же, как и раковые клетки животных, способны к неограниченному росту. Опухолеродным агентом у Agro backteria tumefaciens является ее Ti-плазмида. После того как бактерии попадают в пораженные ткани растений, Ti-плазмида проникает в растительные клетки. Затем часть ДНК плазмиды, так называемая Т-ДНК, интегрирует в геном растения. В результате экспрессии интегрированной Т-ДНК образуются белки, которые обеспечивают трансформацию растительных клеток в клетки корончатых галлов.

Ti-плазмида представляет собой кольцевую двухцепо чечную молекулу ДНК, длина которой составляет 150 – т.п.н. В ее состав входят:

• T-ДНК (12 – 20 т.п.н.). T-ДНК встраивается в геном растений и кодирует ферменты биосинтеза фитогормонов и опинов (производных аминокислот). Продукты генов Т-ДНК вызывают образование корончатых галлов;

• vir-область, содержит гены, ответственные за перенос Т-ДНК в геном растений;

• tra-область, включает гены, контролирующие конъю гацию бактерий;

• ori-область, содержит последовательности ДНК, от ветственные за репликацию Ti-плазмиды.

Ti-плазмида содержит два набора генов: один из кото рых экспрессируется в клетках бактерий, другой – в клетках растений. Регуляция экспрессии генов в составе Т-ДНК осу ществляется посредством элементов, функционирующих в клетках растений, в то время как остальные гены находятся под контролем бактериальных промоторов. Необходимо обратить внимание, что для образования корончатых галлов необходимы гены обеих групп.

Возможность использования Ti-плазмид в качестве вектора обусловлена тем, что • круг хозяев агробактерий широк;

• они способны трансформировать практически все двудольные растения, кроме того можно добиться транс формации однодольных растений, в том числе злаков;

• интегрированная в геном Т-ДНК наследуется как доминантный признак.

При создании рекомбинантных векторов на основе Ti-плазмиды чужеродную ДНК встраивают в состав Т-ДНК.

Способность последней интегрировать в геном растений обеспечивает внедрение и чужеродной ДНК.

Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии Векторная система, созданная на основе Ti-плазмид, должна:

• содержать сигналы для переноса и интеграции Т-ДНК в ядерный геном растений;

• содержать промотор, обеспечивающий экспрессию чужеродных генов. Промотор должен обладать достаточной силой и узнаваться РНК-полимеразой растений. Может использоваться регулируемый промотор. Например, промотор генов белков теплового шока. Гены с таким промотором будут экспрессироваться при повышенной температуре. Другой регулируемый промотор – промотор гена малой субъединицы рибулозобисфосфаткарбок силазы (фермент, участвующий в фотосинтезе) активен только в фотосинтезирующих тканях. Часто в генетической инженерии используется промотор гена вируса мозаики цветной капусты. Гены с таким промотором активно экспрессируются во всех тканях;

• содержать маркер, необходимый для селекции трансформированных клеток. В качестве маркеров могут быть использованы гены lux A и lux B, выделенные из ДНК светлячков, и контролирующие синтез люциферазы. Этот белок обеспечивает переход люцефиринов из окисленной формы в восстановленную форму. Такой переход соп ровождается свечением. Также в качестве маркера применяется ген pgfp, выделенный из медузы Acquorea victo ria, контролирует синтез GFP-белка. Трансгенные растения с этим геном светятся зеленым светом в ультрафиолете;

• не содержать онкогенов, подавляющих дифферен цировку растительных клеток.

Рекомбинантные Ti-плазмиды используют для полу чения трансгенных растений. С этой целью раститель ные клетки обрабатывают бактериями, содержащими рекомбинантную плазмиду. Последняя обеспечивает дос тавку чужеродных генов в составе Т-ДНК в растительный геном. Затем из отдельных клеток выращивают трансгенные растения. Следует отметить, что в результате эксперимента не все растительные клетки подвергаются трансформации.

Отбор трансгенных растений от нетрансформированных можно осуществить с помощью маркеров. Если в качестве маркера использовался ген pgfp, то трансгенные растения в отличие от нетрансгенных растений будут светиться в ультрафиолете.

Введение рекомбинантного вектора в клетки модифицируемого организма Гены как в прокариотические, так и экариотические клетки могут быть введены с использованием векторов, сконструированных на основе вирусов. Вирусы способны обеспечить проникновение рекомбинантного вектора внутрь клетки. При этом каждая клетка может получить большое число копий чужеродного гена. Более того, в некоторых случаях вирусы обеспечивают встраивание чужеродного гена в состав клеточного генома.

Возможна доставка чужеродной ДНК в клетки и без участия вирусов. Этот процесс называется трансфекция.

Существуют несколько методов доставки чужеродной ДНК в клетки на основе трансфекции: кальций-фосфатная трансфекция;

микроинъекция;

электропорация;

биобал листическая трансформация, липофекция и др.

Кальций-фосфатная трансфекция является одним из самых простейших методов доставки чужеродной ДНК в клетки. В этом случае к раствору, содержащему ДНК и фосфат, добавляют хлорид кальция. В результате образуются частицы кальциевого преципитата, состоящего из фосфата кальция и ДНК. Преципитатом обрабатывают клетки, которые путем фагоцитоза поглощают частицы.

В составе преципитата внутрь клеток проникает и ДНК.

Эффективность трансформации клеток таким способом невелика. Ее можно несколько увеличить, используя какие либо вещества, например, глицерин, или этиленгликоль.

Метод микроиньекций широко используется при переносе генов в процессе получения трансгенных животных.

Определенное количество копий генетического материала инъецируется при помощи микропипетки в клеточное ядро (рис. 4.27). Чужеродную ДНК обычно вводят в одноклеточный эмбрион – зиготу.

Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии Рис. 4.27. Метод микроинъекций. С помощью микропипетки в ядро Метод электропорации основан на способности кле точной мембраны становиться проницаемой для молекул ДНК под действием импульсов тока высокого напряжения.

В результате воздействия тока, в мембранах клеток формируются поры, через которые способны проходить молекулы ДНК. При проведении эксперимента (рис. 4.28) в среду вносят клетки и чужеродную ДНК, которую необ ходимо ввести в эти клетки. Через среду пропускают вы соковольтные импульсы электрического тока, приводящие к образованию пор в мембране. Через эти поры ДНК проникает в клетку. Электропорация успешно используется для введения молекул ДНК в клетки животных, простейших, растений, дрожжей, бактерий.

Принцип метода биобаллистической трансформации (рис. 4.29) основан на том, что на мельчайшие частички металла (вольфрама, платины или золота) наносится чуже родная ДНК. Металлические частички, покрытые ДНК, помещаются внутрь биобаллистической пушки. В пушке уменьшается давление до 0,1 атм. В этот момент частички металла с огромной скоростью выстреливаются из пушки и, пробивая мембраны, попадают в цитоплазму и ядра клеток.

Так чужеродная ДНК проникает внутрь клеток.

Рис. 4.29. Биобаллистическая трансформация Метод липофекции основан на использовании липосом для доставки ДНК в клетки. Липосомы представляют собой сферические структуры, оболочки которых образованы бислоем фосфолипидов (рис. 4.30). Их получают в результате обработки ультразвуком или резкого встряхивания водных эмульсий фосфолипидов. При осуществлении липофекции ДНК помещают в липосомы. Таким образом, генетический материал защищается от действия нуклеаз. Липосомы способны сливаться с клеточной мембраной, после чего их содержимое проникает в клетки. Так ДНК доставляется внутрь клеток.

Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии Судьба чужеродной ДНК, внесенной в клетку в резуль тате трансфекции, может быть двоякой. В связи с этим различают стабильную трансфекцию и транзиентную тран сфекцию. В случае транзиентной трансфекции переносимая ДНК не включается в ядерный геном и не реплицируется.

В связи с этим она быстро теряется по мере размножения клеток. При стабильной трансфекции чужеродная ДНК интегрирует в клеточный геном, реплицируется вместе с ним и не теряется в процессе деления клеток.

Конечной задачей генетической инженерии явля ется получение ГМО. Для решения этой задачи после трансформации клеток чужеродным генетическим мате риалом, необходимо отобрать клетки с приобретенными генетическими свойствами. С этой целью могут быть использованы, как указывалось ранее, различные подходы.

На следующем этапе трансформированные клетки яв ляются основой для получения ГМО. Так из отдельной трансформированной растительной клетки можно получить фертильное трансгенное растение. При получе нии же трансгенных животных необходимо предварительно трансформировать половые клетки или зиготу, поскольку из соматических клеток животных нельзя вырастить животное.

Глава 5. ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ ПРОКАРИОТ Генетическая инженерия прокариот зародилась в 70-х годах XX века. Наиболее излюбленным объектом ее исследования с тех пор является E.coli. К настоящему вре мени получены и другие генетически модифицированные бактерии: Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Bacillus brevis, Acremonium chrysogenum, Zymomonas mobilis, Erwinia herbicola, Corynebacterium glutamicum и др.

Конечной целью генетической инженерии бактерий обычно является получение продуцентов каких-либо белков, например, инсулина, гормона роста и др., а также получение генетически модифицированных микроорганизмов, создан ных для решения определенных задач, например, были генетически модифицированы некоторые штаммы Co rynebacterium glutamicum с целью повышения продукции определенных аминокислот. Получены также штаммы бактерий, которые эффективно разрушают токсичные отхо ды, деградируют целлюлозу до низкомолекулярных соеди нений и т.д. Кроме того генетически модифицированные бактерии широко используются в научных исследованиях.

Получение генетически модифицированных бактерий включает следующие этапы:

• получение гена;

• введение чужеродного гена в вектор;

• введение рекомбинантного вектора в бактериальную клетку;

• идентификация клеток, содержащих рекомбинант ный вектор;

•размножение генетически модифицированных бактерий.

Гены могут быть синтезированы или выделены из биологических объектов. Синтез гена возможен, если известна его нуклеотидная последовательность или же первичная структура в нем закодированного белка. В последнем случае первичная структура синтезированного гена может отличаться от первичной структуры природного гена. Это определяется тем, что генетический код вырожден.

В связи с этим по первичной структуре белка практически невозможно воссоздать первичную структуру природного гена. Также возможен синтез гена с использованием ПЦР или с помощью обратной транскрипции иРНК. Кроме того гены могут быть выделены из библиотеки генома или из препаратов ДНК того или иного живого организма. С целью успешной экспрессии, гены должны содержать кроме кодирующих последовательностей и регуляторные области:

промоторы, участки, кодирующие последовательность Шай на-Дальгарно и др. При использовании эукариотических генов последние не должны содержать интронов, поскольку у прокариот отсутствует эукариотическая система сплайсинга.

Исключение интронов из состава генов возможно в процессе их химического синтеза, когда синтезируются нуклео тидные последовательности, соответствующие только экзонам. кДНК, синтезированная в результате обратной транскрипции иРНК, также будет соответствовать кодирую щим последовательностям и отличаться от природного гена отсутствием в своем составе интронов. Таким образом, кДНК может быть использована для синтеза эукариотических белков в бактериальных клетках.

Для доставки чужеродных генов в прокариотические клетки используются векторы, созданные на основе плазмид или вирусов. Разработаны различные подходы введения чужеродного гена в вектор с целью получения рекомбинантного (химерного) вектора. Для решения этой задачи могут быть использованы рестриктазы, полинуклетидполимераза, лигазы. Более подробно вопрос об организации векторов и способах введения в их состав чужеродной ДНК рассмотрен ранее в теме «Введение гена в вектор и получение рекомбинантного вектора».

Рекомбинантный вектор на следующем этапе необходимо доставить в бактериальную клетку. Векторы, созданные на основе вирусов, проникают внутрь клетки, используя способность вирусов инфицировать бактерии.

Для введения химерных векторов на основе плазмид в бактериальные клетки могут быть использованы метод электропорации или высокотемпературное воздействие в сочетании с обработкой клеток хлоридом кальция. Следует отметить, что эффективность трансформации при этом невысока. В связи с этим на следующем этапе возникает необходимость отбора бактериальных клеток, содержащих рекомбинантную плазмиду.

При трансформации бактериальных клеток с помощью pBR322 чужеродный ген в этот вектор встраивают в один из двух генов устойчивости к антибиотику. Тогда бактерии, захватившие рекомбинантную плазмиду, приобретут устойчивость только к одному антибиотику, ген которого остался интактным. Поскольку при создании рекомбинантного вектора не все молекулы pBR подвергаются рекомбинации, поэтому в среде, в которой обрабатывают бактериальные клетки при их трансформации, будут присутствовать молекулы и нерекомбинантного вектора pBR322. Такие векторы могут быть также захвачены бактериями. По завершению процедуры трансформации в среде будут присутствовать три вида клеток: клетки, не захватившие плазмиду pBR322, клетки, захватившие рекомбинантную плазмиду pBR322, и клетки, захватившие нерекомбинантную плазмиду pBR322. Из этой смеси необходимо отобрать клетки, содержащие рекомбинантную плазмиду. С этой целью бактерии высевают на среду, содержащую тот антибиотик, ген устойчивости к которому интактен в обеих плазмидах. В этих условиях бесплазмидные клетки не способны расти. Клетки же бактерий, содержащие как рекомбинантную, так и нерекомбинантную плазмиду, образуют колонии. На основании чувствительности к антибиотику, ген устойчивости к которому нарушен в рекомбинантной плазмиде, можно различить колонии кле ток с рекомбинантной и нерекомбинантной плазмидами.

Для этого часть клеток каждой колонии тестируют на их чувствительность к данному антибиотику. Клетки бактерий, содержащих нерекомбинантную плазмиду, будут расти в присутствии данного антибиотика, в то время как клетки с рекомбинантной плазмидой в этих условиях не растут.

В генетической инженерии широко используют векторы, несущие одновременно ген устойчивости к антибиотику и ген бета-галактозидазы, например вектор pUC 18. Бета-галактозидаза катализирует расщепление субстрата X-gal с образованием окрашенного в голубой цвет продукта. Последний придает колониям клеток голубую окраску. При использовании таких векторов встраивание чужеродной ДНК осуществляют в ген бета галактозидазы. Бактерии, содержащие рекомбинантную плазмиду, будут расти в присутствии соответствующего антибиотика, и будут при этом бесцветными. В то время как бактерии, содержащие нерекомбинантную плазмиду, будут также расти в присутствии антибиотика и будут при этом голубыми. При этом бесплазмидные бактериальные клетки в присутствии антибиотика погибнут. Используя вышеописанную особенность, можно после трансформации бактериальных клеток из смеси клеток (бесплазмидных клеток, клеток, содержащих рекомбинантную плазмиду, и клеток, содержащих нерекомбинантную плазмиды) выде лить клетки с рекомбинантной плазмидой.

Экспрессия генов, клонированных Интеграция гена в состав вектора не гарантирует того, что он будет экспрессироваться с образованием функционально активного продукта. Чтобы обеспечить экспрессию чужеродного гена, необходимо перед ним поместить бактериальный промотор и регуляторные участ ки (рис. 5.1).

Рис. 5.1. Для успешной экспрессии перед чужеродным геном должен располагаться промотор и последовательность ДНК, кодирующая участок С целью повышения эффективности транскрипции чужеродных генов перед ними размещают сильные промоторы. Такие промоторы благодаря высокому сродству к РНК-полимеразе обеспечивают высокую скорость синтеза иРНК. Предпочтительнее использовать регулируемые про моторы. Экспрессию генов с таким промоторами можно регулировать. При определенных условиях гены будут молчать, при других – эффективно транскрибироваться.

В генной инженерии прокариот широко используются промоторы lac- и trp-оперонов E.coli и др. Промотор lac оперона обеспечивает эффективную транскрипцию при высокой концентрации лактозы (или изопропил--D-тио галактопиранозида) и цАМФ и при низкой концентрации глюкозы. В других условиях он обуславливает низкий уровень транскрипции. Иным способом регулируется промотор trp-оперона. Он выключается при наличии в среде высокой концентрации триптофана. При удалении триптофана или добавлении в среду 3-индолакриловой кислоты происходит активация данного промотора.

Часто стоит задача перед исследователями – получение большого количества белка. Для достижения этой цели необходимо соблюсти следующие условия: поместить перед геном сильный промотор и добиться наличия большого числа копий молекул вектора в клетке. Для получения большого количества белкового продукта была создана плазмида рСР3. В ее состав входят сильный промотор, ген устойчивости к ампицилину, сайт инициации репликации, обеспечивающий при повышении температуры увеличение на порядок числа копий плазмиды в клетке, полилинкер с несколькими сайтами узнавания для рестриктаз, по которым встраивают чужеродный ген. Бактерии, содержащие такие плазмиды, вначале выращивают при 28 °С, а затем – при 42 °С. При низкой температуре клетки делятся, при этом промотор не функционирует, и в клетке содержится обычное число копий плазмиды. Повышении температуры до 42 °С приводит к увеличению на порядок числа копий плазмиды и активации промотора. В результате в клетке происходит сверхсинтез белкового продукта. Его выход может составлять около 20 % от общего количества белка.

Увеличить количество копий гена в клетке можно не только за счет увеличения копийности плазмид, но и в результате встраивания в состав вектора нескольких копий генов. Очевидно, увеличение числа генов в клетке обычно сопровождается усилением экспрессии генов и повыше нием синтеза чужеродного белка.

Эффективность экспрессии чужеродных генов зависит не только от силы промотора и числа копий гена в клетке, но и от первичной структуры участка связывания с рибосомой (последовательность Шайна-Дальгарно), расположенной перед инициирующим кодоном в иРНК.

Этот участок закодирован в составе вектора и находится сразу же за промотором. Последовательность Шайна Дальгарно состоит из 6 – 8 нуклеотидов, которые спарива ются с комплементарной последовательностью рРНК малой субъединицы рибосомы. Прочность связывания между мРНК и рРНК определяет эффективность трансляции. Чем прочнее связывание между иРНК и рРНК, тем эффективнее трансляция. Кроме того, для успешной трансляции необ ходимо, чтобы инициирующий кодон находился на опре деленном расстоянии от последовательности Шайна Дальгарно.

Экспрессию генов в прокариотических клетках можно оптимизировать с помощью подбора при их синтезе таких кодонов, которые наиболее эффективно транслируются. Одна и та же аминокислота в силу вырожденности кода может быть закодирована разными кодонами, которые прочитываются соответственно разными тРНК. Концентрации последних в клетках прокариот могут значительно отличаться. Если в гене преобладают кодоны, которым соответствуют тРНК, присутствующие в клетке в больших концентрациях, то в этом случае синтез белка будет осуществляться эффективно.

Если же в гене преобладают кодоны, которым соответствуют тРНК, присутствующие в низких концентрациях, то синтез белка будет осуществляться не эффективно. Т.е. кон центрация тРНК может определять скорость синтеза белка.

Чужеродные белки в прокариотических клетках могут подвергаться деградации. В этом случае получить их в ощутимых количествах не удается. Решить эту проблему можно путем интеграции чужеродного гена в экспрес сирующийся ген вектора. Тогда будет синтезироваться гибридный белок, содержащий полипептидные фрагменты чужеродного (маркерного) и бактериального белков (рис. 5.2).

Такие гибридные белки устойчивы в бактериальных клетках.



Pages:     | 1 || 3 | 4 |
 




Похожие материалы:

«МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ САРАТОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ Н.И. ВАВИЛОВА АГРАРНАЯ НАУКА В XXI ВЕКЕ: ПРОБЛЕМЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ Сборник статей VIII Всероссийской научно-практической конференции САРАТОВ 2014 1 УДК 378:001.891 ББК 4 Аграрная наука в XXI веке: проблемы и перспективы: Сборник ста тей VIII Всероссийской научно-практической конференции. / ...»

«из ФОНДОВ РОССИЙСКОЙ ГОСУДАРСТВЕННОЙ БИБЛИОТЕКИ А5аев, Василий Васильевич 1. Параметры текнолозическозо процесса оБраБотки почвы дисковым почвооБраБатываютцим орудием 1.1. Российская государственная Библиотека diss.rsl.ru 2003 Л5аев, Василий Васильевич Параметры текнологического процесса о5ра5отки почвы дисковым почвоо5ра5атываю1цим орудием [Электронный ресурс]: Дис. . канд. теки, наук : 05.20.01 .-М.: РГЕ, 2003 (Из фондов Российской Государственной Библиотеки) Сельское козяйство — Меканизация ...»

«Министерство сельского хозяйства РФ Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Мичуринский государственный аграрный университет Б.И. Смагин, С.К. Неуймин Освоенность территории региона: теоретические и практические аспекты Мичуринск – наукоград РФ, 2007 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com УДК 332.122:338.43 ББК 65.04:65.32 С50 Рецензенты: доктор экономических наук, профессор И.А. Минаков доктор ...»

«УДК 634.42:631.445.124 (043.8) Инишева Л.И. Почвенно-экологическое обоснование комплексных мелиораций. – Томск: Изд-во Том. Ун-та, 1992, - 270с.300 экз. 3804000000 В монографии представлен подход к мелиоративному проектированию комплексных мелиораций с позиции генетического почвоведения. На примере пойменных почв южно- таежной подзоны в пределах Томской области рассматриваются преимущества данного подхода в мелиорации. Проведенные исследования на 4 экспериментальных мелиоративных системах в ...»

«МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Пермская государственная сельскохозяйственная академия имени академика Д.Н. Прянишникова И.А. Самофалова СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ КЛАССИФИКАЦИИ ПОЧВ Учебное пособие Допущено Учебно-методическим объединением вузов Российской Федерации по агрономическому образованию в качестве учебного пособия для подготовки магистров, обучающихся по направлению ...»

«Н. В. Гагина, Т. А. Федорцова МЕТОДЫ ГЕОЭКОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ Курс лекций МИНСК БГУ 2002 1 УДК 550.8 ББК 26.3 Г12 Р е ц е н з е н т ы: кафедра физической географии Белорусского государственного педагогического университета им. М. Танка; заведующий научно-исследовательской лабораторией экологии ландшафтов Белорусского государственного университета, доцент, кандидат сельскохозяйственных наук В. М. Яцухно; Печатается по решению Редакционно-издательского совета Белорусского государственного ...»

«У к р а и н с к а я академия аграрных наук Национальный научный центр И н с т и т у т почвоведения и а г р о х и м и и им. А . Н . С о к о л о в с к о г о В. В. Медведев Твердость почвы Х А Р Ь К О В - 2009 УДК 631.41 В.В.Медведев. Твердость почв. Харьков. Изд. КГ1 Городская типо- графия, 2009, 152 с. Книга написана с целью популяризации твердости почв и ее более ши рокого использования в почвоведении, земледелии и земледельческой меха нике. Рассмотрены факторы, влияющие на твердость, ...»

«МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ УЧРЕЖДЕНИЕ ОБРАЗОВАНИЯ ГРОДНЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ХV МЕЖДУНАРОДНАЯ НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ СОВРЕМЕННЫЕ ТЕХНОЛОГИИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОГО ПРОИЗВОДСТВА МАТЕРИАЛЫ КОНФЕРЕНЦИИ (Гродно, 27 апреля, 18 мая 2012 года) В ДВУХ ЧАСТЯХ ЧАСТЬ 2 ЭКОНОМИКА БУХГАЛТЕРСКИЙ УЧЕТ ТЕХНОЛОГИЯ ХРАНЕНИЯ И ПЕРЕРАБОТКИ ОБЩЕСТВЕННЫЕ НАУКИ Гродно ГГАУ 2012 УДК 631.17 (06) ББК М ХV М е ж д у н а р о д н а я ...»

«Министерство образования Республики Беларусь Учреждение образования Гомельский государственный университет имени Франциска Скорины Т. А. Колодий, П. В. Колодий ЛЕСОЭКСПЛУАТАЦИЯ Практическое руководство по подготовке и оформлению курсовых проектов для студентов специальности 1-75 01 01 Лесное хозяйство Гомель УО ГГУ им. Ф. Скорины 2010 УДК ББК К Рецензенты: технический инспектор труда Гомельского обкома профсоюза работников леса, С. П. Поздняков; доцент кафедры лесохозяйственных дисциплин ...»

«Е.В. Шеин КУРС ФИЗИКИ ПОЧВ Рекомендовано УМО по классическому университетскому образованию в качестве учебника для студентов высших учебных заведений, обучающихся по направлению 510700 Почвоведение и специальности 013000 Почвоведение ИЗДАТЕЛЬСТВО МОСКОВСКОГО УНИВЕРСИТЕТА 2005 УДК 631 ББК 40.3 Ш 39 Печатается по решению Ученого совета Московского университета Федеральная целевая программа Культура России на 2005 г. (подпрограмма Поддержка полиграфии и книгоиздания России) Рецензенты Заведующий ...»

«Раздел 1. КОРМЛЕНИЕ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ И ТЕХНОЛОГИЯ КОРМОВ УДК 636.4.084 СБАЛАНСИРОВАННОСТЬ РОССЫПНЫХ КОМБИКОРМОВ ДЛЯ СВИНОМАТОК А.А. ХОЧЕНКОВ РУП Научно-практический центр НАН Беларуси по животноводству г. Жодино, Минская обл., Республика Беларусь, 222160 (Поступила в редакцию 20.12.2009) Введение. Современная комбикормовая промышленность Беларуси для кормления свиноматок выпускает как россыпные, так и гранули рованные комбикорма. Обе формы комбикормов имеют свои достоин ства и ...»

«МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ АССОЦИАЦИЯ ИСПЫТАТЕЛЕЙ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ ТЕХНИКИ И ТЕХНОЛОГИЙ (АИСТ) СРАВНИТЕЛЬНЫЕ ИСПЫТАНИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ ТЕХНИКИ Москва 2013 УДК 631.3-048.24 ББК 40.72 С 75 Под общ. ред. председателя ассоциации испытателей сельскохозяйственной техники и технологий (АИСТ) В.М. Пронина Авторы: П.И. Бурак, В.М.Пронин, В.А.Прокопенко, А.А.Медведев, Т.Б. Микая, С.Н. Киселев, М.Н.Жердев, Г.А.Жидков, В.И.Масловский, В.В.Конюхов, Л.В.Колодин, ...»

«ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ ГОУ ВПО ВОЛГОГРАДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ВОЛЖСКИЙ ГУМАНИТАРНЫЙ ИНСТИТУТ (ФИЛИАЛ) ВОЛГУ А.С. Акишин, М.М. Подколзин, А.С. Акишин Земельные ресурсы России и Волгоградской области и формирование новой аг- ропродовольственной политики (2005—2012 годы) Учебное пособие ВОЛГОГРАДСКОЕ НАУЧНОЕ ИЗДАТЕЛЬСТВО 2008 338.43 УДКУДК ББК 65.32-51+65.281 А39 Научный редактор д-р с.-х. наук, проф. Л.И. Сергиенко [ВГИ (филиал) ВолГУ] Рецензенты: д-р экон. наук, проф. ...»

«И.Г. Крымская Гигиена и экология человека Соответствует Федеральному государственному образовательному стандарту (третьего поколения) Среднее профессиональное образование И. Г. К р ы м ск ая ГИ ГИ Е Н А И ЭКОЛОГИЯ ЧЕЛО ВЕКА Учебное пособие Рекомендовано Международной Академией науки и практической организации производства в качестве учебного пособия для студентов образовательных учреждений среднего профессионального образования Издание 2-е, стереотипное Ростов-на-Дону Феникс 2012 УДК ...»

«Вы – свет мира Евангелие от Матфея, глава 5, стих 14 И, зажегши свечу, не ставят ее под сосудом, но на подсвечнике, и светит всем в доме. Евангелие от Матфея, глава 5, стих 15 Книга издана при поддержке Благотворительного фонда “Під покровом Богородиці”. Вы – свет мира Очерки жизни Владимира Леонидовича Бандурова Запорожье 2013 УДК 63(477.64)(092)Бандуров В. Л. ББК 65.9(4 Укр–4 Зап 5 Пол)32-03д В 92 Вы – свет мира. Очерки жизни Владимира Леони В 92 довича Бандурова / Н. Кузьменко, В. Манжура, ...»

«Министерство сельского хозяйства Российской Федерации Министерство сельского хозяйства и продовольстия Свердловской области ФГБОУ ВПО Уральская государственная сельскохозяйственная академия XIII МЕЖДУНАРОДНАЯ НАУЧНО–ПРАКТИЧЕСКАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ СТУДЕНТОВ, АСПИРАНТОВ И МОЛОДЫХ УЧЕНЫХ МОЛОДЕЖЬ И НАУКА 2011 Участие молодых ученых в реализации Государственной программы развития сельского хозяйства и регулирования рынков сельскохозяйственной продукции, сырья и продовольствия на 2008–2012 годы ...»

«Министерство Природных Ресурсов Федеральная служба по надзору в сфере природопользования Государственный природный заповедник Полистовский УДК Утверждаю: Директор заповедника Регистрационный № _ Яблоков М.С. Инвентарный № __2009 г. Тема: Динамика явлений и процессов в природном комплексе заповедника ЛЕТОПИСЬ ПРИРОДЫ Книга 9 2008 год Стр. Ст. научный сотрудник Черевичко А.В. Карт. Фото Диагр. 30 мая 2009 г. СОДЕРЖАНИЕ Территория заповедника 1. Пробные и учётные площади, ключевые участки, ...»

«Министерство Природных Ресурсов Федеральная служба по надзору в сфере природопользования Государственный природный заповедник Полистовский УДК Утверждаю: Директор заповедника Регистрационный № _ Яблоков М.С. Инвентарный № __2008 г. Тема: Динамика явлений и процессов в природном комплексе заповедника ЛЕТОПИСЬ ПРИРОДЫ Книга 8 2007 год Стр. 124 Ст. научный сотр. Ларионова С.Ю. Карт. Фото Диагр. 2 12 декабря 2008 г. СОДЕРЖАНИЕ Территория заповедника 1. Пробные и учётные площади, ключевые участки, ...»

«Министерство Природных Ресурсов Федеральная служба по надзору в сфере природопользования Государственный природный заповедник Полистовский УДК Утверждаю: Директор заповедника Регистрационный № _ Яблоков М.С. Инвентарный № __2008 г. Тема: Динамика явлений и процессов в природном комплексе заповедника ЛЕТОПИСЬ ПРИРОДЫ Книга 7 2006 год Стр. 111 Ст. научный сотр. Ларионова С.Ю. Карт. Фото Диагр. 6 8 февраля 2008 г. СОДЕРЖАНИЕ Территория заповедника 1. Пробные и учётные площади, ключевые участки, ...»






 
© 2013 www.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.